PinX1的原核表達(dá)、純化及其與hTERT的相互作用

廉攀峰，程龍，關(guān)鑫，鄒大陽，梅玲，李俊杰，張菊會，王恩群，葉棋濃

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.安徽醫(yī)科大學(xué) 附屬安慶市立醫(yī)院口腔科，安徽 安慶 246003

Pin2/TRF1結(jié)合蛋白X1（Pin2/TRF1-interacting protein X1，PinX1）是一種新型的Pin2/TRF結(jié)合蛋白，其編碼基因位于染色體8p22-23區(qū)域。PinX1近來被鑒定為一個新型抑癌基因[1-2]，其發(fā)揮作用的機(jī)制是以其TID結(jié)構(gòu)域與人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）結(jié)合而抑制端粒酶活性，調(diào)控端粒長度并調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究表明，PinX1在許多人類癌細(xì)胞中有高頻率雜合性缺失（LOH），胃癌、大腸癌及白血病患者的PinX1表達(dá)水平明顯下降，而在這些癌組織中端粒酶活性顯著增強(qiáng)[3-5]。然而，PinX1基因在腫瘤細(xì)胞中對端粒酶活性的調(diào)控，以及在細(xì)胞癌變中的具體作用機(jī)制目前尚不十分清楚。

為進(jìn)一步探討PinX1對端粒酶活性的調(diào)節(jié)及其分子機(jī)制，進(jìn)而研究PinX1基因在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的功能，我們構(gòu)建了PinX1基因的原核表達(dá)載體，并進(jìn)行了表達(dá)、鑒定和純化，此外還驗(yàn)證了原核表達(dá)的PinX1蛋白與hTERT的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞293T、大腸桿菌BL21、克隆載體pET-32a由本室保存；hTERT表達(dá)載體FLAG-hTERT由黃君健教授贈送；Pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒均為Promega公司產(chǎn)品；His抗體購自Sigma公司；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；測序由北京博邁德生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 PinX1基因片段的擴(kuò)增

以乳腺文庫為模板，根據(jù)GenBank中PinX1基因（NM_017884）序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增用上游引物（5'-CG GAATTCATGTCTATGCTGGCTGAACG-3'）和下游引物（5'-CCCAAGCTTTTTGGAATCTTTCTTCTTCTTC T-3'），上下游引物分別攜帶EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，按95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1.5 min進(jìn)行30個循環(huán)，72℃延伸7 min。

1.3 pHis-PinX1質(zhì)粒的構(gòu)建與測序

在37℃下，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切pET-32a載體4 h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收載體大片段；將PCR產(chǎn)物回收后再用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，用T4DNA連接酶連接入pET-32a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，振蕩培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，將酶切鑒定正確的克隆送北京博邁德生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 His-PinX1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建的表達(dá)PinX1的重組質(zhì)粒和表達(dá)His的空載體pET-32a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，轉(zhuǎn)化子于37℃振蕩過夜，再按2%的接種量轉(zhuǎn)接到5 mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2～3 h，當(dāng)D600nm值達(dá)到0.6～0.8后，加入IPTG至終濃度為0.1 mol/L，于37℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，4℃、3000 r/min離心10 min，收集菌體，加入2×SDS-PAGE緩沖液后電泳鑒定。

1.5 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增

采用Western印跡鑒定His-PinX1。樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉于室溫封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的His單克隆抗體，室溫輕搖1 h，用TBST洗膜3次，每次7 min，用化學(xué)反光法顯色5 min，壓片顯影。

1.6 His-PinX1蛋白的純化

收集上述誘導(dǎo)菌，利用His-PinX1蛋白可結(jié)合His磁珠的特點(diǎn)，用His磁珠顆粒純化PinX1融合蛋白。即按10∶1的比例加入細(xì)胞裂解液（50 mmol/L Tris-HClpH7.5，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.3 mmol/L DTT，1 g/L NP-40，蛋白酶抑制劑），超聲波破碎，離心收集上清液，加入適量His磁珠顆粒，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合4 h，再收集His磁珠顆粒，充分洗脫未結(jié)合的蛋白質(zhì)，即得到結(jié)合有His-PinX1蛋白的磁珠顆粒。

1.7 PinX1與hTERT的相互作用分析

將人胚腎細(xì)胞293T以70%密度，用不含雙抗、含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基接種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，按Vigofect說明書轉(zhuǎn)染方法將帶Flag標(biāo)簽的hTERT真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，4～6 h后換培養(yǎng)基，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞加入IP緩沖液500 μL，冰上裂解細(xì)胞30 min，超聲波破碎細(xì)胞后4℃、12 000 r/min離心10 min，將純化的His-PinX1融合蛋白加到細(xì)胞裂解液中，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合3～6 h后3000 r/min離心收集珠子，用緩沖液充分洗脫未結(jié)合蛋白，West?ern印跡檢測2種蛋白質(zhì)之間的直接相互作用。

2 結(jié)果

2.1 PinX1基因片段的PCR擴(kuò)增

以乳腺文庫為模板，PCR擴(kuò)增PinX1基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物約980 bp，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切重組質(zhì)粒pHis-PinX1，得到與預(yù)期片段大小相符的外源基因插入片段（圖2），而對照pET-32a經(jīng)同樣雙酶切后無插入片段，說明克隆成功。序列測定證明，His-PinX1編碼區(qū)序列完全正確（數(shù)據(jù)略）。

圖2 EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒

2.3 His-PinX1的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒和pET-32a分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的工程菌在相對分子質(zhì)量約57×103處有特異性表達(dá)條帶（圖3）；Western印跡鑒定表明，這些特異性表達(dá)帶可與His抗體發(fā)生特異反應(yīng)，說明His-PinX1重組菌成功表達(dá)了His-PinX1蛋白（圖4）。

2.4 His-PinX1蛋白的純化

含有重組質(zhì)粒pHis-PinX1的轉(zhuǎn)化菌經(jīng)19℃誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)His磁珠親和純化后，獲得了高純度目的蛋白（圖5）。

2.5 PinX1與hTERT相互作用分析

為進(jìn)一步證實(shí)純化的His-PinX1可與hTERT蛋白在體外直接相互作用[1]，將帶有His-PinX1的純化珠子與過量表達(dá)Flag-hTERT的293T細(xì)胞裂解液于4℃結(jié)合后進(jìn)行Western印跡，結(jié)果顯示與His空珠子孵育的樣品利用Flag-HRP抗體檢測無特異條帶，而與His-PinX1珠子孵育的樣品能檢測到特異的hTERT蛋白條帶（圖6），說明PinX1蛋白與hTERT蛋白能夠特異地相互作用。

3 討論

端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA模板和發(fā)揮催化作用的酶組成，可調(diào)節(jié)端粒長度。近年來對端粒酶進(jìn)行了大量研究，表明端粒酶活性與惡性腫瘤密切相關(guān)，且端粒酶表達(dá)水平與腫瘤的預(yù)后有關(guān)[6-9]。端粒、端粒酶對腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。研究表明，PinX1可直接結(jié)合于端粒酶的RNA組分，阻斷端粒酶RNA，從而使其喪失活性，破壞其模板功能，導(dǎo)致端粒酶活性的下降和端粒的縮短，從而發(fā)揮抑癌基因的作用[10-13]。

圖3 SDS-PAGE檢測His-PinX1的表達(dá)

圖4 Western印跡鑒定His-PinX1的表達(dá)

我們以人乳腺文庫DNA為模板，克隆得到PinX1基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pHis-PinX1，SDSPAGE和Western印跡檢測證明我們構(gòu)建的His-PinX1表達(dá)成功。在人腎胚細(xì)胞293T中轉(zhuǎn)染并純化得到hTERT蛋白后，檢測證實(shí)PinX1與hTERT存在相互作用。下一步實(shí)驗(yàn)將深入探討PinX1與hTERT的相互作用定位，以及PinX1抑制端粒酶活性的分子機(jī)制，為探討PinX1基因在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義奠定基礎(chǔ)。

圖5 His-PinX1蛋白的純化

圖6 Western印跡檢測PinX1蛋白與hTERT蛋白的相互作用

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