蔣忠科，張洋，郭連宏，姜蓉，孫承航

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具有血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2酪氨酸激酶抑制作用的鏈霉菌次生代謝產(chǎn)物2754R的研究

蔣忠科，張洋，郭連宏，姜蓉，孫承航

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所

分離鑒定鏈霉菌 I06A-02754 發(fā)酵液中具血管內(nèi)皮生長因子受體-2 酪氨酸激酶（VEGFR2-CD）抑制活性的強極性次生代謝產(chǎn)物。

采用大孔吸附樹脂、陰離子交換樹脂、MPLC、HPLC 等分離手段對次生代謝產(chǎn)物進行分離純化；通過 UV、IR、 HR-ESI 質(zhì)譜、1D-NMR 和2D-NMR 對其結(jié)構(gòu)進行鑒定，以ELISA 法檢測其次生代謝產(chǎn)物對 VEGFR2-CD 的抑制活性；以 MTT 法檢測化合物對腫瘤細胞的抑制活性。

從發(fā)酵液的水溶性部分分離得到一個極性較大的胡桃霉素類次生代謝產(chǎn)物——2754R；其化學(xué)結(jié)構(gòu)與胡桃霉素 D 一致，對 VEGFR2-CD 表現(xiàn)出一定的抑制活性；MTT 實驗顯示化合物 2754R 對 HepG2 細胞、MCF-7 細胞和 BEL-7402 細胞沒有明顯的抑制活性（IC50> 10 μmol/L）。

化合物 2754R 是具有 VEGFR2-CD 活性的胡桃霉素類次生代謝產(chǎn)物。

血管內(nèi)皮生長因子受體 2； 鏈霉菌屬； 胡桃霉素 D

腫瘤血管的形成依賴于血管生長因子，如果阻斷這種生長因子，則可以抑制腫瘤的生長[1-2]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是同腫瘤血管形成、生長、轉(zhuǎn)移及調(diào)節(jié)腫瘤脈管的通透性等方面密切相關(guān)的關(guān)鍵生長因子，同其受體（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3）相結(jié)合發(fā)揮作用[3-5]。由于VEGF 的活性主要由 VEGFR2 來介導(dǎo)[5-7]，因此，以VEGFR2 為靶點開發(fā)抗腫瘤藥物是重點研究方向。以 VEGFR2 為靶點的抗腫瘤藥物已有一些上市，如 Sorafenib、Sunitinib、Pazopanib 等[8]。VEGFR2-CD 是 VEGFR2 的胞內(nèi)區(qū)，具有受體酪氨酸激酶活性。Zhao 等[9]和 Solowiej 等[10]研究表明，VEGFR2-CD 抑制劑對 VEGFR2 同樣具有抑制活性，并認為其作為酪氨酸激酶抑制劑篩選模型是可行的。通過以 VEGFR2-CD 為靶點的酶抑制劑篩選，獲得了一株陽性鏈霉菌株——I06A-02754，并從其發(fā)酵液水溶性部分分離得到具有 VEGFR2-CD抑制活性的強極性化合物 2754R。本文報道了化合物 2754R 的分離純化和結(jié)構(gòu)確認及其對 VEGFR2-CD 的抑制活性和對腫瘤細胞的細胞毒作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 菌株 鏈霉菌 I06A-02754 來自本所菌種篩選中心，由本所生物工程室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

⑴種子和發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽浸膏 5 g、葡萄糖5 g、蛋白胨5 g、牛肉浸膏 5 g、玉米漿 4 g、黃豆餅 10 g、淀粉 20 g、碳酸鈣 4 g、蒸餾水 1 L，pH = 7.1。

⑵斜面 ISP2（YM）培養(yǎng)基：酵母粉 4 g、麥芽浸膏粉 10 g、葡萄糖 4 g、瓊脂 12 g、蒸餾水1 L，pH = 7.1。

1.1.3 試劑 三氟乙酸（TFA）、乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯化鈉均為北京化工廠生產(chǎn)，分析純；HPLC 級乙腈為美國 SK Chemicals 公司產(chǎn)品；重組 KDR-CD、吐溫-20、Poly(E4Y)、Na3VO4為美國 Sigma 公司產(chǎn)品；小鼠磷酸化的酪氨酸抗體（PY99）為美國 Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品；辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠 IgG（H + L）抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化酶顯色底物 TMB/H2O2由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供；MTT 購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 緩沖液 PBS 緩沖液：KH2PO40.024%、Na2HPO40.363%、KCl 0.02%、NaCl 0.8%，pH = 7.4；PBST 緩沖液：0.1% 吐溫-20 的 PBS 緩沖液。

1.1.5 分離填料 XAD-5 型大孔吸附樹脂和201 × 4 強堿性陰離子交換樹脂購自天津南開大學(xué)化工廠；ODS-C18 柱色譜介質(zhì)為日本 Shimadzu 公司產(chǎn)品；Sephadex LH-20 為瑞典 Pharmacia 公司產(chǎn)品，上?；瘜W(xué)試劑廠分裝，裝入 1.5 cm × 100 cm玻璃柱；HP-20 大孔吸附樹脂為日本三菱化學(xué)公司產(chǎn)品；中壓液相色譜柱 ULTRA PACK ODS30/50（15 mm × 300 mm）、高效液相色譜半制備柱Zorbax SB-C18（9.4 mm × 250 mm，5 μm）和高效液相色譜分析柱 Zorbax SB-C18（9.4 mm × 150 mm，5 μm）均為美國安捷倫公司產(chǎn)品。

1.1.6 儀器 1200 型高壓液相色譜儀為美國安捷倫公司產(chǎn)品；Buchi-011 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為瑞士步琪公司產(chǎn)品；Anke TDL-40B 型低速離心機購自北京科瑞公司；Modulyo 型真空冷凍干燥機為英國愛德華公司產(chǎn)品；FMI-C 型中壓液相色譜儀為日本 Yamazen 公司產(chǎn)品；680 型酶標比色儀為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的發(fā)酵 將斜面培養(yǎng)基上生長良好的菌株 I06A-02754 接種至含 50 ml 種子培養(yǎng)基的 250 ml 三角燒瓶中，在 28 ℃和 250 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 48 h，再按 5% 的接種量轉(zhuǎn)接于含 100 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基的 500 ml 三角瓶中，于 28 ℃、250 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 96 h，收獲發(fā)酵液。

1.2.2 2754R 的分離純化及條件優(yōu)化 I06A-02754菌株發(fā)酵液原分離條件為布氏漏斗濾去菌絲后，先后通過 XAD-5 型大孔樹脂及201 × 4 強堿性陰離子交換樹脂，然后用 HP-20 樹脂脫鹽。脫鹽后的粗品濃縮上樣于Sephadex LH-20 柱，50% 甲醇洗脫，最后將所得紅色半純品用中壓色譜純化，15% 乙腈（0.05% TFA）洗脫，得化合物 2754R。但該分離提取步驟較為煩瑣，根據(jù)化合物 2754R 含有羧基，在酸性溶液中穩(wěn)定性好的結(jié)構(gòu)特點，我們對分離條件進行了優(yōu)化，將 XAD-5 大孔樹脂流出樣品的 pH 值調(diào)為 4.0，然后再用乙酸乙酯萃取，旋蒸后得桔黃色活性粗品A，粗品A 上樣于SephadexLH-20 柱，60% 甲醇洗脫，收集橙色活性帶，濃縮得半純品，最后用反相半制備 HPLC 純化，制備條件如下：流動相為 15% 乙腈水溶液（0.05% TFA），流速為 1 ml/min，檢測波長 254 nm，收集保留時間為 11.6 min 的峰，離心濃縮除去乙腈和水，得化合物 2754R，純度大于 95%。

1.2.3 活性檢測方法

1.2.3.1 ELISA 法檢測化合物VEGFR2-CD 抑制活性 采用 10 倍稀釋法，獲得化合物2754R 濃度為 10、1、0.1、0.01、0.001 mg/ml 的樣品，根據(jù)文獻[11]的方法檢測化合物VEGFR2-CD 抑制活性。本實驗中設(shè)立樣品空白對照，抑制率（%）= [1 –（450樣品/450空白對照）]× 100%。

1.2.3.2 MTT 法測定化合物對腫瘤細胞的抑制活性[12]將對數(shù)生長期細胞用胰酶消化后配制成濃度為 1 × 104個/ml 的細胞懸液，接種于 96 孔板，每孔 100 μl，培養(yǎng) 24 h；每孔加入含不同濃度化合物（10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L）及相應(yīng)溶劑對照的新鮮培養(yǎng)基 100 μl（DMSO 終濃度 < 0.1%）；每組設(shè) 3 個平行孔，于 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 72 h 之后加以無血清培養(yǎng)基新鮮配制的 0.5 mg/ml MTT 100 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h；最后每孔加入 150 μl DMSO 溶解甲瓚顆粒，用微型振蕩器振蕩混勻后，酶標儀測定值（參考波長 450 nm，檢測波長 570 nm）。以溶劑處理腫瘤細胞為對照組，按下述公式計算化合物對腫瘤細胞的抑制率：

抑制率（%）=（對照組平均值–化合物組平均值）/對照組平均值× 100%。

2 結(jié)果

2.1 2754R 的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 2754R 為橙色無定型粉末，易溶于甲醇、乙腈和二甲基亞砜，不溶于環(huán)己烷，微溶于水；溶于堿性水溶液，且在堿性溶液中共軛體系變長，呈紅色。2754R 在甲醇溶液中的紫外光譜（UV）在 227、283 和 409 nm 處有最大吸收。IR 在 2400 ~ 3500 cm-1有一寬峰，3187、3081、1695、1631、1610、1579、1290、1205 和 724 cm-1處有較強吸收。比旋光度為 +78.2°（濃度為 0.435 mg/ml，甲醇）。1H-NMR（CD3OD，600 Mz）δ：2.37（1H，dd，J = 8.4，15.6，3'-H），2.44（1H，dd，J = 4.2，15.6，3'-H），2.71（1H，dd，J = 6.6，12.6，1'-H），4.28（1H，m，2'-H），2.81（1H，dd，J = 7.2，12.6，1'-H），7.15（1H，d，J = 8.4，6-H），7.54（1H，d，J = 8.4，8-H），7.60（1H，t，J = 8.4，7-H）；13C-NMR（CD3OD，150 Mz）δ：32.14（C-1'），42.93（C-3'）， 68.44（C-2'），114.95（C-4a），119.88（C-8），122.49（C-2），123.94（C-6），134.07（C-8a），138.11（C-7），162.31（C-5），175.52（C-4'），175.77（C-3），185.87（C-1），186.59（C-4）。

圖 1 2754R 的平面結(jié)構(gòu)（A）及HMBC（ ）和1H-1H COSY（ ）相關(guān)圖（B）

化合物2754R 的 ESI-MS（+）顯示其準分子離子峰為 293（M + H）+、315（M + Na）+、331（M + K）+；因此可以確定該化合物的分子量為 292。HR-ESI-MS：[M-H]-實測值為 291.04741，計算值為 291.05048，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR 綜合分析，確定該化合物的分子式為 C14H10O7。通過對1H-NMR、13C-NMR、HSQC 和 DEPT 譜的綜合分析可知分子中有 8 個季碳（δC：186.59，185.87，175.51，162.31，157.77，134.07，122.48，114.94），4 個次甲基碳（δC：138.11，123.93，119.88，68.44）和 2 個亞甲基碳（δC：42.92，32.14），共 14 個碳原子，其中 3 個為羰基碳信號（δC：186.59，185.87，175.51），8 個為烯碳信號（δC：162.31，157.77，138.11，134.07，123.93，122.48，19.88，114.94）。在1H-1H COSY 譜中，δ：7.60（1H，t，J = 8.4 Hz，7-H）和 δ：7.54（1H，d，J = 7.2 Hz，6-H）、δ：7.15（1H，d，J = 8.4 Hz，8-H）相關(guān)；在 HMBC 中，8-H、6-H 和 C-4a，7-H 和 C-5、C-8a 相關(guān)。因此，結(jié)合 HSQC、1H-1H COSY 和 HMBC，化學(xué)位移為 134.07（C-8a）、114.95（C-4a）和 162.31（C-5）的 3 個季碳和化學(xué)位移為 123.94（C-6）、138.11（C-7）和 119.88（C-8）的 3 個叔碳組成一個 1,2,3 三取代的芳環(huán)。此外，在1H-1H COSY 中，9-H、11-H 和 δ：4.28（1H，m，10-H）的相關(guān)峰能被觀察到，結(jié)合在 HMBC 中的 9-H 和 C-11（δ：42.93），11-H 和 C-9（δ：32.14）、C-12（δ：175.52）的相關(guān)峰，可以確定分子中含有一個 2'-羥基丁酸側(cè)鏈；HMBC 中，1-H 和 C-1（δ：185.87）、C-3（δ：157.77）、C-2（δ：122.49），8-H 和C-1（δ：185.87）在1H-NMR（DMSO-6）中共有3 個化學(xué)位移為 11，一個化學(xué)位移為 4.9 的活潑氫，以及 C-3 的化學(xué)位移為157.77，C-5 的化學(xué)位移為 162.31，表明 C-3 和 C-5 為連氧的烯碳。此外，IR 數(shù)據(jù)也印證了芳香環(huán)、羰基及活潑氫的存在。綜合以上信息可以推斷出該化合物的結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。

經(jīng)查閱文獻[13]，2754R 的1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)與胡桃霉素 D 幾乎完全一致，因此，確定 2754R 為已知的化合物胡桃霉素 D。

2.2 2754R 的 VEGFR2-CD 抑制活性

應(yīng)用ELISA 法檢測其對 VEGFR2-CD 的抑制活性，結(jié)果分別為 20.2%、14.7%、6.1%，當(dāng)濃度低至0.01 mg/ml 時則未表現(xiàn)出對 VEGFR2-CD 的抑制活性。由以上結(jié)果可知：2754R 對VEGFR2-CD 有弱的抑制活性，其抑制活性呈濃度依賴性。

2.3 2754R 的細胞毒活性

MTT 實驗顯示，2754R 對人肝癌 HepG2 細胞、人乳腺癌 MCF-7 細胞和人肝癌BEL-7402 細胞在所測的濃度范圍（0.001 ~ 10 μmol/L）均未表現(xiàn)出抑制活性。表明 2754R 對以上腫瘤細胞沒有明顯的抑制作用。

3 討論

抗生素一般產(chǎn)量低，成分復(fù)雜，分離提取困難，尤其是水溶性組分更難分離，但對一些酸性或堿性化合物，通過pH 的改變，可以改變其極性，便能用簡單、常規(guī)的萃取方法實現(xiàn)快速提取?；衔?2754R 含有游離的羧基及羥基，極性偏大，在 pH為 7.5 的發(fā)酵液中處于水溶性狀態(tài)，大大增加了分離純化的難度。后續(xù)分離純化研究中，我們將流出液的 pH 調(diào)為 4.0 左右，這樣化合物 2754R 在溶液中的解離度大大降低，脂溶性增強，可用乙酸乙酯進行萃取，濃縮后用甲醇溶解，再上樣于 Sephadex LH-20 柱，并進一步用反相半制備 HPLC純化，大大提高了分離的效率。

化合物 2754R 為具有VEGFR2-CD 抑制活性的胡桃霉素類化合物，這類化合物的母核結(jié)構(gòu)為胡桃醌，胡桃醌屬萘醌類化合物，因存在于胡桃科核桃屬植物胡桃楸和核桃的樹皮、根皮、青果皮及葉中而得名。胡桃醌具有明確的抗腫瘤作用，對 S180 實體瘤、小鼠腹水型肝癌、自發(fā)性胃癌及小鼠移植型乳腺癌等均具有明顯的抗癌活性[14-15]。有研究表明，胡桃醌在體外細胞水平及器官水平對內(nèi)皮血管形成具有明顯的抑制作用[16-17]。來源于微生物的胡桃霉素類化合物最早由日本學(xué)者報道[18]，隨后德國哥廷根大學(xué)的 Laatsch 研究組陸續(xù)報道了一系列的胡桃霉素類化合物，包括其二聚體。該類化合物具有抗革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及真菌的活性，也有一定的細胞毒性[13,19-21]?；衔?2754R 在酶的水平上表現(xiàn)出一定的對VEGFR2-CD的抑制活性，但 MTT 實驗顯示該化合物對所測的腫瘤細胞沒有明顯的抑制活性，原因可能是其極性較大，較難穿透細胞膜。本文首次報道了胡桃霉素 D 的VEGFR2-CD 抑制活性，拓展了酪氨酸激酶抑制劑的范圍，為合成新的酪氨酸激酶抑制劑，進而發(fā)現(xiàn)靶向抗血管生成藥物開拓了新的思路。

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Study of the secondary metabolite 2754R produced byas inhibitor of VEGFR2-CD

JIANG Zhong-ke, ZHANG Yang, GUO Lian-hong, JIANG Rong, SUN Cheng-hang

To discover antagonists of VEGFR2-CD from the fermentation broth produced bystrainI06A-02754.

Under guidance of ELISA assay against VEGFR2-CD, compound 2754R was isolated and purified by combination of different column chromatographies and HPLC. The structure of compound 2754R was identified by combination of analysis of UV, IR, HR-ESI-MS and1D-NMR,2D-NMR. The cytotoxicity of compound 2754R was tested by MTT assay.

Compound 2754R was purified and structurally identified as Juglomycin group antibiotics, and was the same with Juglomycin D. Compound 2754R showed weak antagonistic activity against VEGFR2-CD by ELISA assay, but did not show obvious cytotoxicity on HepG2 (), BEL-7402 (human hcarcinoma) and MCF-7 (human breast cancer) cell lines at 10 μmol/L.

It is firstly reported compound 2754R (Juglomycin D) has antagonistic activity against VEGFR2-CD.

Vascular endothelial growth factor receptor-2;; Juglomycin D

JIANG Rong, Email: jr5602@yahoo.com; SUN Cheng-hang, Email: chenghangsun@hotmail.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.004

國家自然科學(xué)基金（81172963）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301-002-001-018）；北京市自然科學(xué)基金（7133249）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項（IMBF201204）

姜蓉，Email：jr5602@yahoo.com；孫承航，Email：chenghangsun@hotmail.com

2013-11-15

Author Affiliation: Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China