潘蕓，高麗華，邵勇，王友亮，高招剛，段海峰，胡顯文

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hDll1ext-Fc融合蛋白的表達純化與初步鑒定

潘蕓，高麗華，邵勇，王友亮，高招剛，段海峰，胡顯文

230601 合肥，安徽大學生命科學院（潘蕓、高招剛）；100071 北京，軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所（高麗華、邵勇、王友亮、胡顯文），放射與醫(yī)學研究所（段海峰）

獲得高效表達 hDll1ext-Fc 融合蛋白的細胞系以及具有生物學活性的目的蛋白。

根據(jù)已知序列設(shè)計引物，并將 hDll1ext基因片段經(jīng) PCR 擴增，酶切后連接至 pIRES2-EGFP-Fc 中，挑選陽性克隆測序，將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 CHO-S 細胞，篩選高表達細胞系，利用 rProtein A 親和柱純化目的蛋白，并通過檢測 Notch 下游信號分子 Hes1 的表達及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測蛋白活性。

構(gòu)建了 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 真核表達載體，并篩選了高效表達 hDll1ext-Fc 的 CHO-S 細胞系，純化得到較高純度的融合蛋白，配合生物活性檢測實驗顯示，可溶性的 hDll1ext-Fc 能夠激活 Hes1 報告基因，并且能上調(diào) Notch 下游分子 Hes1 的表達，證明其能夠激活 Notch 信號通路。

在 CHO-S 細胞中成功表達了 hDll1ext-Fc 融合蛋白，為進一步研究 Delta-like-1 的生物學功能奠定重要基礎(chǔ)。

配體，Notch； CHO 細胞； Delta-like； Fc融合蛋白

基因首先在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，由于該基因的缺失會導致果蠅翅膀邊緣出現(xiàn)缺口（notch）而得名。Notch 信號傳導通路廣泛存在于脊椎與非脊椎動物體內(nèi)，它是決定細胞命運的重要路徑之一[1]。Notch 受體是由胞外區(qū)（extracellular Notch，ECN）和跨膜區(qū)/胞內(nèi)區(qū)（Notch transmembrane，NTM）兩個亞基組成的異二聚體，兩者是通過共價鍵結(jié)合在一起的，并具有 Ca2+依賴性。果蠅中有2 種 Notch 配體，Delta 和 Serrate。線蟲中 Notch 配體有 Lag2。哺乳動物中有多重 Notch 配體，與 Delta 高度相似的配體稱為 Delta 或 Delta 樣（Delta-like，Dll），與 Serrate 相似的稱為 Serrate 或 Jagged。目前發(fā)現(xiàn)人的 Notch 配體共有 5 種，即 Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4、Jagged1、Jagged2。作為人重要 Notch 配體之一的 Delta 樣配體 1 是由 723 個氨基酸組成的單次跨膜蛋白，其中胞外區(qū)含有 539 個氨基酸，由 1 個 N 端保守的 DSL（Delta/Serrate/Lag2）基序和 8 個表皮生長因子樣重復序列（epidermal growth factor-like repeats，EGF-R）結(jié)構(gòu)域組成，具有重要的生物學活性[2]。該 DSL 結(jié)構(gòu)域結(jié)合 Notch 受體，促進受體異二聚體分離，進而受體活化激活下游信號，Notch 受體經(jīng)過三次剪切，最終胞內(nèi)區(qū)釋放到細胞核，激活發(fā)狀分裂相關(guān)增強子（hairy and enhancer of split，Hes）等靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)節(jié)細胞分化和組織發(fā)生[3]。

近幾年研究表明，Notch 信號傳導通路與腫瘤發(fā)生有關(guān)，如 Purrow 等[3]發(fā)現(xiàn) Notch 配體 hDll1 在多種神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤中過度表達，并且在聯(lián)合其他細胞因子的情況下，hDll1 胞外區(qū)可以抑制造血干細胞的分化并促進其增殖[4]。魯茁壯等[5]克隆表達了 hDll1 的胞外區(qū)，并經(jīng)過集落培養(yǎng)檢測證實其對原始的造血祖細胞具有擴增作用。因此，本實驗通過構(gòu)建胞外區(qū)全基因與人 IgG1 Fc 融合的真核表達質(zhì)粒，并在 CHO-S 細胞中表達純化得到較高純度且具有生物活性的 hDll1ext-Fc（human Delta-like-1 extracellular domain-Fc）融合蛋白，為后續(xù)的功能研究奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pIRES2-EGFP-Fc 質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建保存；人 Delta-like-1 胞外區(qū)全基因由金斯瑞公司合成，以 pUC57-hDll1ext質(zhì)粒的形式提供；CHO-S 細胞株為本實驗室保存；Pyrobest DNA 聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP 購自日本 Takara 公司；T4 DNA 連接酶以及限制性內(nèi)切酶I、dIII、H I 購自美國 NEB 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、DNA 上樣緩沖液、DNA marker 均購自天根公司；蛋白標準分子量購自加拿大Fermentas 公司；轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000 購于美國 Life Technologies 公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清以及 CD CHO 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；rProtein A 填料購自美國GE 公司；酶標抗體購自北京中杉金橋公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Thermo 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega 公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 和 pGL3-basic-1(promoter) 質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1.1 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)已知 hDll1ext基因序列設(shè)計引物 DllF 和 DllR，以合成的 pUC57-hDll1ext質(zhì)粒為模板，PCR 擴增得到特異性目的片段，經(jīng)I 和H I 雙酶切克隆至 pIRES2-EGFP-Fc 載體中，轉(zhuǎn)化 Top10 感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性克隆雙酶切驗證并送測序。

1.2.1.2 pGL3-basic-1(promoter) 質(zhì)粒的構(gòu)建 以動物細胞全基因組提取試劑盒提取 HeLa 細胞的全基因組，以 HesF1 和 HesR1 為上下游從基因組中擴增出含有目的片段的序列，并最終以 HesF2 和 HesR2 PCR 擴增目的片段，經(jīng)I 和dIII 雙酶切克隆至 pGL3-basic 載體中，轉(zhuǎn)化 Top10 感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性克隆送至測序。

以上所需引物見表 1。

表 1 引物序列信息

1.2.2 高表達細胞系的篩選 根據(jù) Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書將 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CHO-S 細胞，以 750 μg/ml 濃度 G418篩選陽性克隆 2 周，計細胞數(shù)目，稀釋細胞至終濃度為 8 個/ml，96 孔板單克隆，2 周后挑選單克隆，將所挑選細胞系換無血清，第 2 天收集無血清上清，200 倍稀釋后，ELISA 法檢測細胞株的表達水平，并且挑選保留其中表達量最高細胞系進行 Western blot 驗證，一抗為 1000 倍稀釋的兔抗人 Delta1 抗體，二抗為 5000 倍稀釋的 HRP 標記的山羊抗兔 IgG。

1.2.3 hDll1ext-Fc 融合蛋白的純化 搖瓶擴大培養(yǎng)篩選細胞系，收集培養(yǎng)上清，并將收集的 hDll1ext-Fc 上清離心濃縮去除雜蛋白，以 5 ml/min 的流速經(jīng)過 3 倍柱體積結(jié)合液（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 7.3）處理的 rProtein A 親和柱，待上樣完畢后，平衡液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.3）洗雜蛋白至基線后，用洗脫液（0.1 mol/L Gly-HCl，0.9% NaCl，0.5% 吐溫-80，pH 3.0）洗脫蛋白，飽和精氨酸調(diào)節(jié) pH 至中性，保存于4 ℃。以 50 mmol/L NaOH 處理親和柱，去除殘留蛋白，并用 5 倍柱體積去離子水清洗柱子，最終以 20% 乙醇保存柱子，以防長菌。BCA 試劑盒測定純化蛋白的濃度。

1.2.4 hDll1ext-Fc 的考馬斯亮藍 G250 快速染色 SDS-PAGE 使用 10% 的分離膠和 5% 的濃縮膠，將收集的蛋白過濾除菌，取 30 μl 樣品與 4 × 上樣緩沖液混勻后，沸水浴中變性 5 min，上樣，80 V 電壓待膠行至濃縮膠時改用 130 V 電壓，直至跑到終點。取膠，與 500 ml ddH2O 微波爐中煮沸 3 ~ 5 min，倒去 ddH2O，加入考馬斯亮藍 G250 染色液，煮沸 3 ~ 5 min?；厥杖疽?，加入 500 ml ddH2O，煮沸 3 ~ 5 min，搖床脫色 5 min。倒去 ddH2O，看膠是否已脫色完畢，如果沒有，可以重復以上步驟進行第 2 次脫色。

1.2.5 Western blot 檢測 Notch 下游靶基因1 的表達 以 5 × 105個/ml 密度將 HeLa 細胞接種于 6 孔板，次日分別加入終濃度為 8 μg/ml 重組 hDll1ext-Fc 或?qū)φ?Fc，24 h 后以 RIPA（pH 7.4 50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS，終濃度為 1 mmol/L PMSF）裂解細胞，SDS-PAGE 分離裂解物，360 mA 恒定電流 1 h 電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉 1 h，用 1:500 稀釋的兔抗 Hes1 單克隆抗體，1:1000 鼠抗 β-actin 抗體 4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜 3 次，用 1:5000 稀釋的 HRP 標記的山羊抗兔 IgG 抗體以及山羊抗鼠 IgG 抗體 37 ℃孵育1 h，TBST洗膜 3 次，發(fā)光，顯色。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測 hDll1ext-Fc 融合蛋白活性 以 2 × 105個/ml 密度接種 HeLa 細胞于 24 孔板，第 2 天用 Lipofectamine2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 200 ng 報告基因質(zhì)粒 pGL3-basic-1 (promoter) 和 10 ng 內(nèi)參質(zhì)粒 pRL，6 h 后換 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，分別加入終濃度為 1、2、4、8 μg/ml 重組蛋白 hDll1ext-Fc，轉(zhuǎn)染 48 h 后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理

以雙熒光素酶（firefly）活性與內(nèi)參海腎腔腸素酶（renilla）活性的比值，顯示熒光素酶的相對活性。Excel 和 SPSS 15.0 軟件處理，采用單因素方差分析，以< 0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 質(zhì)粒的構(gòu)建

以合成的 pUC57-Dll1ext為模板 PCR 擴增，經(jīng)瓊脂糖電泳分析，在 1500 bp 左右得一特異條帶，與預期大小一致（圖 1），并以I 和H I 雙酶切克隆至pIRES2-EGFP-Fc，挑選陽性克隆送測序，結(jié)果正確。

bp M 1 4500300020001200800500

Figure 1 PCR amplification of hDll1ext(M: DNA marker III; 1: hDll1ext)

2.2 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及單克隆篩選

參照 Lipofectamine2000 說明書將 pIRES2- EGFP-hDll1ext-Fc 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CHO-S 細胞，24 h 后熒光顯微鏡檢測可見熒光（圖 2A），轉(zhuǎn)染效率在30% ~ 40% 之間，750 μg/ml 濃度 G418 加壓篩選，10 d 左右形成成簇細胞群，此時消化細胞，細胞計數(shù)儀測定細胞濃度為 2.3 × 105個/ml，將細胞稀釋 3 × 104倍，使得每 200 μl 培養(yǎng)基中含有 1 ~ 2 個細胞，96 孔板單克隆，每孔加入 200 μl 培養(yǎng)基，共單克隆 10 個 96 孔板，10 d 后顯微鏡觀察可見成團的單克?。▓D 2B），挑選由 1 個細胞擴增得到的細胞團，共篩選得到 40 株單克隆細胞株。

圖 2 轉(zhuǎn)染細胞綠色熒光圖（A：轉(zhuǎn)染 24 h 后熒光下的 CHO-S 細胞；B：96 孔板中形成成簇的單克隆細胞；40 ×）

Figure 2 The fluorescence of transfected cells (A: Transfected CHO-S cell after 24 hours; B: The monoclonal cell in 96-well plate; 40 ×)

2.3 hDll1ext-Fc 培養(yǎng)上清的 ELISA 檢測及 Western blot 驗證

將篩選的 40 株細胞株換成 200 μl 無血清培養(yǎng)基，第 2 天，ELISA 檢測表達量，波長 405 nm 處測定值，如表 2 所示有 3 株細胞值在 1.0 以上，分別為 2E4、10C7、10H3，凍存上述 3 株細胞株于液氮中保存。取 10C7 培養(yǎng)上清進行 Western blot 驗證，同時以瞬時轉(zhuǎn)染空載體 pIRES2-EGFP-Fc 的細胞上清為陰性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選細胞株 10C7 培養(yǎng)上清在 70 kD 左右出現(xiàn)單一的陽性結(jié)果，且符合理論分子量大小，陰性則無（圖 3），表明所篩選的細胞株能夠正確表達目的蛋白。

2.4 目的蛋白 rProtein A 親和柱純化

將細胞培養(yǎng)上清過濾除菌，以 5 ml/min 的速率通過 rProtein A 親和柱，目的蛋白即牢牢結(jié)合于柱子，以 pH 3.0 Gly-HCl 洗脫，得到單一的洗脫峰（圖 4），洗脫體積為 30 ml左右，最高 UV 值達到 2000 mAu。在線清理系統(tǒng)（Clean- in-Place，CIP）得到 150 mAu 的洗脫峰（圖中未顯示），該峰出現(xiàn)的主要原因是有些目的蛋白結(jié)合于 rProtein A 親和柱過牢，pH 3.0 Gly-HCl 不足以將其洗脫，只有在強堿（50 mmol/L NaOH）的作用下才能洗脫下來。

表 2 單克隆細胞株無血清上清檢測

A B

圖 3 細胞株 10C7 蛋白免疫印跡分析結(jié)果（A：篩選細胞株 10C7 無血清上清；B：瞬時轉(zhuǎn)染空載體 pIRES2-EGFP- Fc 后無血清上清）

Figure 3 Analysis result of Western blot (A: Serum free medium of the cell line 10C7; B: Serum free medium in the condition of transient transfection the empty vector pIRES2- EGFP-Fc)

2.5 洗脫蛋白的考馬斯亮藍快速染色

經(jīng) BCA 試劑盒測定純化所得 hDll1ext-Fc 蛋白濃度為 1.5 mg/ml，取 30 μl 樣品進行 SDS- PAGE，經(jīng)考馬斯亮藍 G250 快速染色后在 70 kD 左右得單一條帶（圖 5），與預期結(jié)果一致，并且如圖所示所得蛋白純度高于 95%。

2.6 hDll1ext-Fc 上調(diào) Notch 下游靶基因Hes1 的表達

Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組 Fc 比較，在細胞數(shù)量基本一致的情況下，hDll1ext-Fc 的加入明顯增強了1 基因的表達（圖 6）。說明可溶性狀態(tài)下的 hDll1ext-Fc 融合蛋白的刺激能夠上調(diào) HeLa 細胞 Notch 下游信號分子1 基因的表達，該蛋白在可溶性條件下即能發(fā)揮生物學功能。

圖 4 pH3.0 Gly-HCl 洗脫目的蛋白純化洗脫峰

Figure 4 The eluting peak of purified protein by pH 3.0 Gly-HCl

bp M 1 170130957255433426

Figure 5 The SDS-PAGE of hDll1ext-Fc protein (M: Standard protein marker; 1: Purified interest protein)

圖 6 hDll1ext -Fc 上調(diào) Hes1 的表達

Figure 6 hDll1ext-Fc fusion protein up-regulated the expression of Hes1

2.7 雙熒光素報告基因檢測可溶性 hDll1ext-Fc 融合蛋白的活性

2.7.1 pGL3-basic-1(promoter) 質(zhì)粒的構(gòu)建 以人的基因組為模板 PCR 擴增得到包含1 基因啟動子的 2300 bp 左右的基因序列，結(jié)果與預期一致（圖 7A）。經(jīng)I和d III 雙酶切克隆至載體 pGL3-basic，挑選陽性克隆送測序結(jié)果正確。

kb M 1 321A

Figure 7 Result of Dual-Luciferase Reporter Assay [A: PCR result of Hes1 promoter; M: 1kb DNA ladder; 1:1 promoter; B: Co-transfect 10 ng internal reference pRL and 200 ng pGL3-basic-1(promoter) in HeLa, Dual-Luciferase Reporter Assay in different concentration of recombination protein (1, 2, 4, 8 μg/ml) acts on the HeLa cells transfected after 48 hours, data are representative of three independent experiments (*< 0.05;**< 0.01;***< 0.001 vs control)]

2.7.2 雙熒光素酶檢測融合蛋白的生物學活性 將上述構(gòu)建質(zhì)粒以及內(nèi)參質(zhì)粒 pRL 同時轉(zhuǎn)染 HeLa 細胞，不同濃度 hDll1ext-Fc 融合蛋白處理細胞，48 h 后，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測結(jié)果顯示，對應(yīng) 1、2、4、8 μg/ml 蛋白濃度，firefly 活性與renilla 活性比值分別為 0.194、0.340、0.463、0.893。可以看出，同對照組 0.187 相比，重組的 hDll1ext-Fc 融合蛋白能夠激活 Notch 信號通路，并且隨著濃度的增加，Notch 信號通路激活的程度也不斷增強（圖 7B）。

3 討論

有限的臍帶血干細胞不足以滿足提供給成人的干細胞移植，并且異體移植存在嚴重的排斥反應(yīng)，甚至引起患者死亡。近年來干細胞的體外增殖研究成為醫(yī)學界的熱門領(lǐng)域之一[6]。Notch 信號傳導通路目前被認為是解決干細胞擴增的最有前途的研究方向之一，hDll1 作為人 Notch 通路重要的配體，成為各國科學家研究的重要方向。近期研究發(fā)現(xiàn) Notch信號通路的激活能夠引起小鼠造血祖細胞（HSPC）的擴增[7]，并且在 NOD-SCID 免疫缺陷小鼠模型中，通過 Dll1ext擴增的臍帶血干細胞具有顯著的快速多向分化功能[8]。

鑒于以上，本實驗構(gòu)建了 hDll1 胞外功能區(qū)與免疫球蛋白 IgG1 Fc 片段的真核表達質(zhì)粒，載體帶有 EGFP 的熒光標記，易于后續(xù)單克隆的篩選，由于帶有 IgG1 的 Fc 片段有利于 hDll1ext-Fc 的純化，直接采用 rProtein A 親和柱即可得到高純度的目的蛋白，并且大大延長了其在生物體內(nèi)的半衰期。通過 Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，可溶性的 hDll1ext-Fc 能夠顯著上調(diào) Notch 下游1 基因的表達，同時我們將 Notch 信號通路靶基因1 的啟動子整合至 pGL3-basic 載體中，下游是熒光素酶基因，當 Notch 信號通路激活后，下游靶基因1 的啟動子激活，熒光素酶基因就會表達，兩者共同證明重組得到的可溶性 hDll1ext-Fc 能夠激活 Notch 信號通路，具有生物學活性。

之前部分學者認為 Notch 配體在固定化的狀態(tài)下才能激活 Notch 通路[9]，但是本實驗表明可溶性的 hDll1ext-Fc 同樣能發(fā)揮生物學功效，特別在 8 μg/ml 濃度作用更為明顯，兩者存在分歧的主要原因可能是作用濃度的不同，前者的作用濃度一般在 ng/ml 水平，確切的機制有待于進一步研究。

總之，本次實驗選用 CHO-S 細胞進行的 hDll1ext-Fc 蛋白的表達，為進一步的蛋白功能評價及其在干細胞增殖等方面的研究提供了基礎(chǔ)保障。

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Expression, purification and preliminary identification of hDll1ext-Fc fusion protein

PAN Yun, GAO Li-hua, SHAO Yong, WANG You-liang, GAO Zhao-gang, DUAN Hai-feng, HU Xian-wen

To obtain the CHO-S cell lines expressing hDll1ext-Fc (human Delta-like-1 extracellular domain-Fc) fusion protein and the target protein with biological activity.

The hDll1extgene was amplified through PCR with the primers designed according to the known sequences, then inserted into pIRES2-EGFP-Fc vector, transformed into the competent cells. The positive clones were screened for sequencing. The recombinant plasmid pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc was transfected into the CHO-S cells, and then the high expressed cell lines were screened and the interest protein was purified with affinity rProtein A column. The biological activity of hDll1ext-Fc was determined by Dual-Luciferase Reporter Assay and the express of Hes1 which is a downstream factor in Notch pathway.

We obtained the eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc, high expressed cell lines and high purified hDll1ext-Fc fusion protein. The experiment of biological activity showed that soluble hDll1ext-Fc activated Hes1 reporter gene and up-regulated the expression of Hes1.

The recombinant plasmid pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc is constructed and the fusion protein is expressed, which lays the important foundation of further study on its biological function.

Ligand, Notch; CHO cells; Delta-like; Fc fusion protein

HU Xian-wen,Email: huxw1969@163.com

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(2011ZX09102-001-30、2012ZX09102301-001)

胡顯文，Email：huxw1969@163.com

2013-12-06

Author Affiliations: School of Life Science, Anhui University, Hefei 230601, China (PAN Yun, GAO Zhao-gang); Institute of Biotechnology (GAO Li-hua, SHAO Yong, WANG You-liang, HU Xian-wen), Institute of Radiation Medicine (DUAN Hai-feng), Academy of Military Medical Science, Beijing 100071, China