劉毅華，童梅，劉金毅，徐晨

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基于SM 蛋白的CHO細(xì)胞分泌工程化改造和抗體表達(dá)的研究

劉毅華，童梅，劉金毅，徐晨

210009 南京，中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（劉毅華）；102600 北京三元基因工程有限公司（童梅、劉金毅、徐晨）

通過構(gòu)建基于 SM 基因的分泌工程化改造的 CHO-AV-SM 細(xì)胞株，探討在懸浮培養(yǎng)條件下，過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 SM 基因?qū)Ψ置诘鞍妆磉_(dá)的影響。

首先從人 HEK293FT 細(xì)胞中克隆出s1 和18c基因，然后構(gòu)建含有 SM 基因的真核表達(dá)載體 pBSM；隨后將 pBSM 質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入 CHO-AV 細(xì)胞并鑒定，獲得了基于 SM 基因的分泌工程化改造的 CHO-AV-SM 細(xì)胞株；在此基礎(chǔ)上對 CHO-AV-SM 細(xì)胞株進(jìn)行懸浮培養(yǎng)適應(yīng)，并測定了 CHO-AV 和 CHO-AV-SM 細(xì)胞株的生長和蛋白表達(dá)參數(shù)。

過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 SM 基因，CHO-AV-SM 細(xì)胞株的抗體表達(dá)量較 CHO-AV 抗體表達(dá)量提高約 75%，且測得第 6 天細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，此時 CHO-AV 的表達(dá)量約為 45.4 μg/ml，CHO-AV-SM 的表達(dá)量為 79.5 μg/ml。

通過構(gòu)建全抗穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞，在細(xì)胞中過表達(dá) SM 基因，并懸浮培養(yǎng)適應(yīng)，建立了懸浮培養(yǎng)條件下基于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過表達(dá)的分泌工程改造方法，為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白改造 CHO 細(xì)胞，提升全抗表達(dá)能力提供了有力支持。

CHO 細(xì)胞； 蛋白質(zhì)工程； SLY1 蛋白質(zhì)類； MUNC18c蛋白質(zhì)類； 貝伐單抗

分泌表達(dá)是真核細(xì)胞表達(dá)基因工程重組蛋白的主要表達(dá)途徑，在外源基因拷貝數(shù)及其轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到瓶頸時，提高細(xì)胞分泌能力有助于重組蛋白表達(dá)量的提升。Sly1/Munc18（SM）蛋白是一類高度保守的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，其中Sly1 調(diào)控囊泡由高爾基體至細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，而Munc18c則調(diào)控囊泡由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。已有研究表明在酵母和人細(xì)胞中過表達(dá) SM 蛋白能夠提高分泌蛋白的表達(dá)量[2]。研究人員把這種基于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過表達(dá)的細(xì)胞改造稱為“分泌工程化改造”[3]。

本研究從人 HEK293FT 細(xì)胞中克隆s1 和18c基因，并構(gòu)建含有 SM 基因的真核表達(dá)載體；然后將構(gòu)建好的 SM 基因共表達(dá)質(zhì)粒 pBSM 導(dǎo)入以貝伐單抗為報(bào)告基因的 CHO-AV 細(xì)胞株中，借以構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)SM 基因的細(xì)胞株CHO-AV-SM。通過運(yùn)用高通量篩選法獲得外源蛋白表達(dá)量較高的工程細(xì)胞株，并對工程細(xì)胞株進(jìn)行懸浮培養(yǎng)適應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，通過比較 CHO-AV- SM 細(xì)胞與 CHO-AV 細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)條件下的生長代謝差異，進(jìn)而驗(yàn)證 SM 蛋白促進(jìn) CHO 細(xì)胞分泌表達(dá)外源蛋白的功能，并為構(gòu)建分泌工程化改造細(xì)胞確立可行的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 CHO-K1 及 HEK293FT 細(xì)胞購自 ATCC；CHO-AV 細(xì)胞由北京三元基因工程有限公司構(gòu)建。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶及 PCR 聚合酶購自寶生物工程有限公司；質(zhì)粒大提、總 DNA、RNA 提取及 TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技有限公司；Lipofactamine2000、pBudCE4.1、pcDNA3.1(+) 及 pVITRO2-neo-mcs 質(zhì)粒、DMEM/F12、CHO 化學(xué)限定培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國 Invitrogen 公司；pcDNA3.1-AVL（輕鏈）、pcDNA3.1-AVH（重鏈）及 pBSM 質(zhì)粒由北京三元基因工程有限公司構(gòu)建；HRP 標(biāo)記羊抗人 κ 二抗購自美國Southern Biotech 公司；羊抗人 Fc 多抗購自美國KPL 公司。

1.1.3 儀器 PTC-100TM 型 PCR 擴(kuò)增儀為美國 MJ Research 公司產(chǎn)品；細(xì)胞恒溫振蕩培養(yǎng)箱為瑞士Adolf Kuhner AG 公司產(chǎn)品；DSZ5000X 型倒置生物顯微鏡購自重慶澳浦光電技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SM 基因的克隆 收集培養(yǎng) 72 h 的HEK293FT 細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用 PBS 洗滌 3 次，參照總 RNA 提取試劑盒說明提取總 RNA，樣品溶解于 50 μl RNase-free ddH2O 中，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA 純度，紫外分光光度測定濃度。參照 TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書，以獲得的總 RNA 為模板，以 Oligo(dT) 為引物反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以 cDNA 作為模板，分別以1 基因的引物1、2 及18c基因的引物18c1、18c2進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析，并用 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切產(chǎn)物分離。切下 1500~2000 bp 之間區(qū)域的目的 DNA 片段1 基因和18c基因，并用 DNA 片段回收試劑盒純化線性目的片段。1 及18c基因的上下游引物序列如下：1 上游：5' CCGCTCGAGAC CATGGCGGCGGCGGCGGCAGCG 3'，下游：5' CG CGGATCCTTACTTTTGTCCAAGTTGTGACAACTG 3'；18c1 上游：5' CCGCTCGAGACCATGGC GCCGCCGGTGGCAGAGAGG 3'，下游：5' CGCGG ATCCCTATTCATCTTTAATTAAGGAGAC 3'。

1.2.2 SM 基因共表達(dá)載體的構(gòu)建 分別將上述回收的1 基因和18c基因以I 和H I 進(jìn)行雙酶切，酶切完成后，用 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切產(chǎn)物分離，切下 1500 ~2000 bp之間區(qū)域的目的 DNA 片段，并用 DNA 片段回收試劑盒純化線性目的片段。使用 T4 DNA 連接酶連接1 基因片段和以II、I 雙酶切的真核表達(dá)載體 pBudCE4.1，將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Top10 感受態(tài)細(xì)胞，挑選測序正確的克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒提取，得到重組質(zhì)粒 pBudCE4.1-1命名為 pBS。將真核表達(dá)載體 pBudCE4.1 和 pBudCE4.1-1 以H I、I 進(jìn)行雙酶切，使用 T4 DNA 連接酶連接雙酶切后的18c基因片段和真核表達(dá)載體 pBudCE4.1 和 pBudCE4.1-1，將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Top10 感受態(tài)細(xì)胞，挑選測序正確的克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒提取，將重組質(zhì)粒 pBudCE4.1-18c 和 pBudCE4.1-1-18c分別命名為 pBM 和 pBSM。

1.2.3 SM 基因共表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 CHO-AV 細(xì)胞株 采用 Lipofactamine2000 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。將 2 × 106個 CHO-AV 細(xì)胞接種 T-25 方瓶，當(dāng) CHO-AV 細(xì)胞密度在 80% ~ 90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將培養(yǎng)基換成 5 ml 無血清 DMEM/F12 培養(yǎng)基，制備質(zhì)粒-培養(yǎng)基混合物（質(zhì)粒 10 μg +無血清培養(yǎng)基 500 μl），同時配置轉(zhuǎn)染試劑-培養(yǎng)基混合物（轉(zhuǎn)染試劑 25 μl +無血清培養(yǎng)基 500 μl），上述混合物分別靜置 5 min 后進(jìn)行混合，靜置 20 min 后加入上述細(xì)胞內(nèi)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng) 6 h，將培養(yǎng)基換成 6 ml 5% 胎牛血清 DMEM/F12 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并運(yùn)用 Zeocin 和有限稀釋法進(jìn)行單克隆篩選。

1.2.4 外源 SM 蛋白表達(dá)的鑒定 收集培養(yǎng) 72 h的轉(zhuǎn)染 SM 基因的 CHO-AV 細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用 PBS 洗滌 3 次，參照動物細(xì)胞總 DNA、RNA、蛋白分離試劑盒的說明分別提取基因組 DNA、總 RNA 和總蛋白，用于 SM 基因的 DNA 水平、mRNA 水平及蛋白水平的檢測。在進(jìn)行基因組 DNA 水平檢測時，以基因組 DNA 作為模板，以引物12以及引物18c118c2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析。在進(jìn)行 mRNA 水平檢測時，參照 TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒，以上步驟中獲得總 RNA 為模板，以 Oligo(dT) 為引物逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA；以 cDNA 作為模板，以引物1、2及引物18c1、18c2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析。在進(jìn)行蛋白水平檢測時，以 CHO-K1 細(xì)胞總蛋白為陰性對照，并將提取的總蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳及 Western blot 鑒定。一抗為鼠抗人sly1 抗體和羊抗人munc18c抗體，二抗為 HRP 兔抗鼠多抗和 HRP 驢抗羊多抗。

1.2.5 ELISA 篩選高表達(dá)細(xì)胞株 運(yùn)用雙抗體夾心 ELISA 測定上清抗體濃度，包被抗體為羊抗人 IgG Fc 抗體，標(biāo)準(zhǔn)品為人 IgG，酶標(biāo)二抗為羊抗人 κ 鏈抗體。從中挑選出抗體表達(dá)量最高的一株細(xì)胞命名為 CHO-AV-SM，進(jìn)行懸浮適應(yīng)。

1.2.6 懸浮培養(yǎng) CHO-AV-SM 細(xì)胞與 CHO-AV 細(xì)胞表達(dá)、生長曲線的測定和比較 CHO-AV-SM 以及 CHO-AV 以 3 × 105個/ml初始細(xì)胞密度接種于 30 ml 無血清培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2、110 r/min 培養(yǎng)。每 24 小時取一次樣（約 500 μl），臺盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，同時離心凍存上清。當(dāng)細(xì)胞活力低于 50% 時，終止細(xì)胞培養(yǎng)。ELISA 檢測各時間點(diǎn)樣品抗體濃度。計(jì)算抗體比產(chǎn)率，繪制活細(xì)胞數(shù)-時間、細(xì)胞存活率-時間、抗體濃度-時間、抗體比產(chǎn)率-時間曲線圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SM 基因的克隆

從 HEK293FT 中提取總 RNA 的電泳結(jié)果如圖 1 所示。圖中 RNA 可見 28s 和 18s 兩條帶且 28s 帶亮度超過 18s，說明所提 RNA 基本未降解；紫外分光光度法檢測總 RNA 濃度為 601 ng/ml。使用1 基因引物和18c基因引物分別進(jìn)行 RT-PCR 后，電泳結(jié)果如圖 2 所示，1 片段電泳條帶在約 1930 bp，18c片段電泳條帶約在 1780 bp，大小符合預(yù)期。

bp M RNA 2000 15001000 28s 18s

Figure 1 Total RNA of HEK293FT cells

2.2 共表達(dá)載體鑒定

pBudCE4.1-1、pBudCE4.1-18c 和 pBudCE4.1-1-18c 質(zhì)粒示意圖如圖 3所示。對構(gòu)建的共表達(dá)載體 pBudCE4.1-1、pBudCE4.1-18c和pBudCE4.1-1-18c 進(jìn)行 PCR 鑒定，結(jié)果如圖 4 所示。1 片段和18c片段的電泳條帶分別約 1930 bp 和 1780 bp，大小符合預(yù)期。pBS 大提質(zhì)粒濃度為504 ng/μl，回收體積 1.5 ml；pBM 大提質(zhì)粒濃度為 560 ng/μl，回收體積 1.5 ml；pBSM 大提質(zhì)粒濃度為 613 ng/μl，回收體積 1.5 ml。

bp M sly1 munc18c 20001500

Figure 2 To clone1 and18c gene by RT-PCR from total RNA of HEK293 cells

2.3 SM 基因共表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 CHO-AV 細(xì)胞株

2.3.1 Zeocin 篩選細(xì)胞狀態(tài)觀察及有限稀釋法挑單克隆 24 h 后按照 1:10 消化傳代，48 h 后加 Zeocin 培養(yǎng)。每 3 天換一次培養(yǎng)基，維持 Zeocin 濃度在 200 μg/ml，加壓篩選 12 d。從加 Zeocin 開始 4 ~ 5 d 內(nèi)，細(xì)胞狀態(tài)正常；5 d 后細(xì)胞開始大量死亡，具體表現(xiàn)為細(xì)胞變大膨脹，有些細(xì)胞形狀由梭形變成不規(guī)則形，部分細(xì)胞有明顯空泡形成，有死細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)基中（圖 5A）。10 d后具有抗性的單個細(xì)胞克隆形成（圖 5B）。至 12 d 將所有細(xì)胞克隆消化，有限稀釋法挑單克隆。鋪板 6 ~ 7 d 后在鏡下可看到明顯的單克隆形成（圖 5C）。

圖 3 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖（1：pBudCE4.1-sly1；2：pBudCE4.1-munc18c；3：pBudCE4.1-sly1-munc18c）

Figure 3 Schematic diagrams of plasmid (1: pBudCE4.1-1; 2: pBudCE4.1-18c; 3: pBudCE4.1-1-18c)

bp M1 1 2 3 4 M2bp 20001500 20001500

Figure 4 Determination of1 and18c PCR fragments of plasmid pBudCE4.1-1, pBudCE4.1-18c and pBudCE4.1-1-18c

2.3.2 SM 基因表達(dá)的鑒定

2.3.2.1 基因組水平及轉(zhuǎn)錄水平鑒定 收集培養(yǎng) 72 h 的細(xì)胞抽提基因組 DNA、總 RNA 和總蛋白，將總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以 gDNA 和 cDNA 為模板，分別用1 基因引物1、2 以及18c基因引物18c1、18c2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖 6 ~ 7。1 片段電泳條帶約在 1930 bp，18c片段電泳條帶約在 1780 bp，大小符合預(yù)期。

2.3.2.2 蛋白水平鑒定 CHO-AV 總蛋白為陰性對照，上樣量均為 20 μl，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，使用抗人sly1 抗體和抗人 munc18c 抗體進(jìn)行Western blot 檢測，結(jié)果如圖 8 所示。sly1蛋白理論分子量為72.3 kD，munc18c理論分子量為 67.7 kD。結(jié)果顯示 5 株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞均有人源sly1 和 munc18c 蛋白的表達(dá)，CHO-AV 細(xì)胞自身表達(dá)的sly1 和 munc18c是非人源蛋白，理論上檢測不到，在sly1 和munc18c蛋白分子量理論值附近沒有條帶。

圖 5 鏡下觀察 Zeocin 篩選細(xì)胞狀態(tài)及單克隆細(xì)胞形成（A：細(xì)胞因 Zeocin 篩選大量死亡；B：抗性細(xì)胞克隆形成；C：單克隆示意圖）

Figure 5 Cellular morphology and single clones during Zeocin screening under microscope detection (A: Large number of cells died during Zeocin screening; B: Zeocin resistant cell colony appeared; C: Microscope detection of single colony)

bp M1 g1 g2 g3 g4 g5 g6 M2 c1 c2 c3 c4 c5 c6 M3bp 20001500 20001500

Figure 6 Fragments of1 from gDNA and cDNA of stable expression cells

bp M1 g1 g2 g3 g4 g5 g6 M2 c1 c2 c3 c4 c5 c6 M3bp 20001500 20001500

Figure 7 Fragments of18c from gDNA and cDNA of stable expression cells

kD M 1G11 2F7 3D5 4D10 4C5 CHO-AV 75 60

Figure 8 Western blot of sly1 and munc18c from different clones

2.4 ELISA 篩選高表達(dá)單克隆細(xì)胞株

從有限稀釋的 4 塊 96 孔板中挑選形態(tài)較好的 5 株單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，編號為（96 孔板編號 + 各孔編號）1G11、2F7、3D5、4D10、4C5 并凍存。6 孔板到 T-25 瓶擴(kuò)大過程中收取上清，以 CHO-AV 表達(dá)上清為陰性對照進(jìn)行檢測。結(jié)果如表 1。將表達(dá)量最高的細(xì)胞株 CHO-4C5命名為 CHO-AV-SM，接入搖瓶懸浮適應(yīng)培養(yǎng)。

2.5 懸浮培養(yǎng) CHO-AV-SM 細(xì)胞與 CHO-AV 細(xì)胞表達(dá)、生長曲線的測定和比較

CHO-AV-SM 和 CHO-AV 以 3 × 105個/ml 初始細(xì)胞密度接種于 30 ml CD-CHO 培養(yǎng)基，每 24 小時取樣，以臺盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，同時離心凍存上清。12 d 后終止細(xì)胞培養(yǎng)。ELISA 檢測各時間點(diǎn)樣品抗體濃度。計(jì)算抗體比產(chǎn)率，公式如下：

公式中 qMab：抗體比產(chǎn)率；TH：抗體最終濃度（μg）；TI：抗體初始濃度（μg）；VH：最終細(xì)胞數(shù)（106cells）；VI：接種細(xì)胞數(shù)（106cells）；t：時間（d）。

繪制活細(xì)胞數(shù)-時間、細(xì)胞存活率-時間、抗體濃度-時間、抗體比產(chǎn)率-時間曲線圖。如圖 9 所示，CHO-AV 細(xì)胞在批培養(yǎng)條件下前 6 天細(xì)胞活力維持在約 100%，且第 6 天細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，之后下降，到第 12 天細(xì)胞活力已低于 50%；抗體濃度一直在增加，但抗體比產(chǎn)率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。與參考文獻(xiàn)結(jié)果相比，CHO-AV 生長速率及最大密度有較大差距。

所謂“陽光是最好的防腐劑”⑩，透明度在規(guī)則制定中一直占有重要地位。透明度在公開和保密之間形成張力:政府機(jī)構(gòu)或企業(yè)為追求透明度而公開信息，可能會損害國家安全或商業(yè)秘密等重要利益，不充分的透明度則會導(dǎo)致信任缺失，而無意的披露又可能造成損害隱私或泄露機(jī)密等不利后果。有研究提出大數(shù)據(jù)的“透明悖論”?，即某些機(jī)構(gòu)為了執(zhí)行任務(wù)或提供服務(wù)，會運(yùn)用法律和商業(yè)秘密武器來隱匿其數(shù)據(jù)收集行為及收集的數(shù)據(jù)，因而如何發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)收集行為并要求其實(shí)現(xiàn)透明度呢?

同 CHO-AV 細(xì)胞相比，CHO-AV-SM 細(xì)胞參數(shù)變化趨勢基本一致，如圖 9 所示，前 6 天細(xì)胞活力維持在約 100%，第 6 天細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，之后下降，到第 12 天細(xì)胞活力已低于 50%；抗體濃度一直增加，但抗體比產(chǎn)率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。這提示插入新的外源基因會影響細(xì)胞的生長，但驗(yàn)證了在宿主細(xì)胞過表達(dá)sly1和munc18c的促分泌表達(dá)作用。這兩株細(xì)胞的細(xì)胞密度均在培養(yǎng)第 6 天達(dá)到最大值，此后細(xì)胞大量死亡。由于死細(xì)胞裂解物給培養(yǎng)上清帶來許多雜蛋白，影響產(chǎn)物質(zhì)量。因此我們以第 6 天抗體濃度進(jìn)行比較：此時 CHO-AV 細(xì)胞的抗體表達(dá)量約為 45.4 μg/ml；CHO-AV-SM 細(xì)胞的抗體表達(dá)量為 79.5 μg/ml，在 CHO-AV 基礎(chǔ)上提高約 75%，這與貼壁培養(yǎng)數(shù)據(jù)接近。

表 1 部分高表達(dá)細(xì)胞株抗體表達(dá)量

圖 9 懸浮培養(yǎng)的 CHO-AV-SM 與 CHO-AV 細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)-時間（A）、細(xì)胞存活率-時間（B）、抗體濃度-時間（C）、抗體比產(chǎn)率-時間（D）曲線對比

Figure 9 The comparison of viable cell density (A)、cell viability (B)、antibody titer (C) and Qp (D) between CHO-AV-SM and CHO-AV

將 CHO-AV-SM 細(xì)胞數(shù)據(jù)和 CHO-AV 細(xì)胞數(shù)據(jù)對比，可以看出 CHO-AV 細(xì)胞的生長速率及最大密度略高于 CHO-AV-SM 細(xì)胞，但是 CHO-AV 細(xì)胞的抗體產(chǎn)量和抗體比產(chǎn)率低于 CHO-AV-SM 細(xì)胞。

3 討論

分泌表達(dá)是真核細(xì)胞表達(dá)基因工程重組蛋白的主要表達(dá)途徑。經(jīng)研究表明有多種因素影響抗體基因在 CHO 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，包括抗體基因在宿主染色體上的整合位點(diǎn)、基因拷貝數(shù)、抗體mRNA的轉(zhuǎn)錄效率和 mRNA 的穩(wěn)定性、抗體基因的翻譯、抗體輕重鏈的組裝、分泌以及抗體本身結(jié)構(gòu)等多個方面。在外源基因拷貝數(shù)及其轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力的上限時，提高細(xì)胞分泌能力有助于重組蛋白表達(dá)量的提升。囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌實(shí)質(zhì)上是胞內(nèi)膜分離和融合的循環(huán)過程。研究發(fā)現(xiàn)，所有囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中的胞內(nèi)膜融合過程都需要 SNARE 蛋白家族和SM蛋白家族協(xié)同參與調(diào)節(jié)。其中 SM 蛋白是一類親水性蛋白質(zhì)，由 600 個左右氨基酸組成，其空間結(jié)構(gòu)大致為“弓形”結(jié)構(gòu)蛋白[4]。利用 SM 蛋白促進(jìn)細(xì)胞分泌的特性，近年來人們開始嘗試以介導(dǎo)胞內(nèi)大分子運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白為靶點(diǎn)提高重組蛋白表達(dá)量并取得了突破。Peng和Fussenegger[5]的研究表明，在 CHO 細(xì)胞中過表達(dá)sly1可以使利妥昔單抗的表達(dá)量提高 10 倍，同時表達(dá)Sly1和Munc18c則可以使其產(chǎn)量提高 15 倍。Hou 等[6]構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) SLY1 和 SEC1 的釀酒酵母并分別用來表達(dá)異源蛋白（人胰島素前體、曲霉α-淀粉酶）和內(nèi)源蛋白（轉(zhuǎn)化酵素），結(jié)果各個目的蛋白表達(dá)量均有不同程度的提升。由于 CHO 細(xì)胞與人細(xì)胞的 SM 基因具有較高同源性，推測其 SM 基因調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與人細(xì)胞類似，所以本課題選擇從人細(xì)胞中克隆 SM 基因并進(jìn)行后續(xù)研究。

本研究將含有1 和18c基因的真核共表達(dá)載體導(dǎo)入 CHO-AV 細(xì)胞株，在研究中首先從人細(xì)胞克隆了1 基因和18c基因并構(gòu)建表達(dá)載體 pBS、pBM 和 pBSM。通過 SM 基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，我們獲得的基于 SM 基因的分泌工程化改造的 CHO 細(xì)胞株 CHO-AV-SM 與原細(xì)胞株 CHO-AV 抗體表達(dá)量相比提高約 75%，但與參考文獻(xiàn)中 SM 促表達(dá)效果相比還有差距。這可能是因?yàn)楹Y選得到的 CHO-AV 細(xì)胞表達(dá)量處于較低水平，轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的瓶頸效應(yīng)對其影響較小，因此，SM 基因無法表現(xiàn)出較好的促表達(dá)效果。在后續(xù)工作中應(yīng)該對載體元件和篩選方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，與分泌途徑優(yōu)化一起協(xié)同提高 CHO 工程細(xì)胞株的抗體表達(dá)量[7]。從圖 9可以看出，CHO-AV 細(xì)胞及 CHO-AV-SM 細(xì)胞在批懸浮批培養(yǎng)條件下前 6 天細(xì)胞活力維持在近 100%，且第 6 天細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，之后下降，到第 13 天細(xì)胞活力已低于 50%；抗體濃度持續(xù)增加，但比產(chǎn)率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。與參考文獻(xiàn)結(jié)果相比，各個參數(shù)的變化趨勢大致相同，但生長速率及最大密度低于參考文獻(xiàn)結(jié)果。CHO-AV 細(xì)胞和 CHO-AV-SM 細(xì)胞相比，CHO-AV 細(xì)胞的生長速率及最大密度略高于 CHO-AV-SM細(xì)胞。一種可能是因?yàn)榉€(wěn)定轉(zhuǎn)染后，外源基因隨機(jī)插入基因組，有可能破壞宿主細(xì)胞正常功能的序列，造成不同細(xì)胞單克隆之間生長特性的差異；另一種可能則是外源蛋白的表達(dá)增加了宿主細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，更多的營養(yǎng)物質(zhì)被用來表達(dá)而非生長。所以在篩選過程中不但要考察細(xì)胞的表達(dá)量，還應(yīng)該考察細(xì)胞的生長情況，選擇表達(dá)量高且生長情況良好的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)開發(fā)[8]。另外也可采用定點(diǎn)整合技術(shù)，將外源基因定向插入 CHO 細(xì)胞基因組的高表達(dá)位點(diǎn)，從而提高篩選成功率[9]。

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High expression of antibody in secretion engineered CHO cells based on SM protein

LIU Yi-hua, TONG Mei, LIU Jin-yi, XU Chen

The aim of this study is to investigate the improvement of secreted protein expression by constructing antibody-producing CHO cells based on molecular engineering of secretion, which includes SM gene over-expression and cell adaptation to suspension culture.

In this study, we first cloned1 gene and18c gene from human cells and constructed the eukaryotic co-expression vector. We then successfully transfected the1 and18c genes into CHO-AV cells, and identified the SM protein expressing CHO-AV-SM cells. We next suspended the adapted CHO-AV-SM cells in culture and determined the growth and the expression parameters of CHO-AV and CHO-AV-SM cells.

Due to SM transporter protein gene over-expression, antibody expression of CHO-AV-SM cell line was increased by 75%,as compared with CHO-AV cells. On the sixth day the cell number reached the maximum, and the antibody production of CHO-AV and CHO-AV-SM cells was about 45.4 μg/ml and 79.5 μg/ml, respectively.

This study improves the antibody production of CHO cells by molecular engineering of secretion, which includes SM gene over-expression and cell adaptation to suspension culture. This provides supports to molecular engineering of CHO-cell secretion and antibody production improvement.

CHO cells; Protein engineering; SLY1 proteins; MUNC18C proteins; Bevacizumab

XU Chen, Email: xuchen@triprime.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.003

徐晨，Email：xuchen@triprime.com

2014-05-16

AuthorAffiliations: College of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China (LIU Yi-Hua); Beijing Tri-Prime Genetic Engineering Co., Ltd, Beijing 100260, China (TONG Mei, LIU Jin-yi, XU Chen)