Hilary Sherman，Mark E. Rothenberg

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Corning?hybrigro SF?培養(yǎng)基對(duì)提高雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)密度和抗體產(chǎn)量的研究

Hilary Sherman，Mark E. Rothenberg

200040 上海，康寧生命科學(xué)亞洲技術(shù)中心

近幾年，抗體作為生物類治療藥物的需求顯著增長(zhǎng)。因此，提高抗體生產(chǎn)效率并且降低生產(chǎn)成本愈發(fā)必要。而康寧 hybrigro SF?培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)，正是致力于在不使用昂貴血清的情況下仍能夠高效培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，提高抗體產(chǎn)量。我們使用兩種不同的雜交瘤細(xì)胞株，并通過(guò)與兩種商業(yè)化生產(chǎn)的無(wú)血清培養(yǎng)基以及一種被廣泛使用的含血清培養(yǎng)基對(duì)比，驗(yàn)證 hybrigro SF?培養(yǎng)基在高密度雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白產(chǎn)量方面的優(yōu)越性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及耗材 AE1 購(gòu)自ATCC；10% 胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基均為康寧公司產(chǎn)品；IgG2a ELISA protocol 試劑盒購(gòu)自美國(guó)ADI 公司；Easy titer IgG 分析鑒定試劑盒為美國(guó)Thermo 公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 BioProfile?Flex 分析儀購(gòu)自美國(guó) Nova Biomedical 公司。

1.2 方法

MH677（專利雜交瘤細(xì)胞株）及 AE1 細(xì)胞株使用康寧 hybrigro SF?培養(yǎng)基、兩種無(wú)血清培養(yǎng)基以及含有 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用 BioProfile?Flex 分析儀進(jìn)行分析。將細(xì)胞以 50000 個(gè)/ml 的密度接種至 125 ml 的錐形瓶中，并將錐形瓶置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（5% CO2，37 ℃）以 90 r/min 轉(zhuǎn)速培養(yǎng) 4 d。每天定時(shí)取樣培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞活力、細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)及細(xì)胞代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。同時(shí)，每天取樣培養(yǎng)基，使用 IgG2a ELISA protocol 試劑盒（針對(duì) MH677 細(xì)胞）或 Easy titer IgG 分析鑒定試劑盒對(duì)兩種細(xì)胞的蛋白產(chǎn)量（小鼠 lgG2a）進(jìn)行評(píng)估。

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇 待凍存管中大部分的冰融化后，迅速將凍存管中內(nèi)容物轉(zhuǎn)移，將細(xì)胞以 4 × 105~ 5 × 105個(gè)/ml 的密度接種于新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基中。因細(xì)胞在冷凍過(guò)后十分脆弱，如果使用離心機(jī)進(jìn)行操作，注意使用低速離心。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和活力，并重新開(kāi)始常規(guī)細(xì)胞維持操作。

1.2.2 直接適應(yīng)

⑴在初代培養(yǎng)中，細(xì)胞接種密度建議為常規(guī)細(xì)胞接種密度的 2 倍。

⑵當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 2 × 106~ 3 × 106個(gè)/ml 時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

⑶在 2 ~ 4 代的細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程中，將活細(xì)胞以 2 × 105個(gè)/ml 的接種密度接種于新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 連續(xù)適應(yīng)

通過(guò) 2 ~ 3 代的細(xì)胞培養(yǎng)逐步改變培養(yǎng)基成分：初代培養(yǎng)中將兩種培養(yǎng)基以 50:50 比例制成混合培養(yǎng)基，第一次傳代培養(yǎng)中將 hybrigro SF?培養(yǎng)基比例提高至 75%，以 25:75 比例制成新的混合培養(yǎng)基。細(xì)胞接種密度約為 5 × 105個(gè)/ml。

為了維持hybrigro SF?培養(yǎng)基中細(xì)胞的最佳生長(zhǎng)和生產(chǎn)力狀態(tài)，每 3 ~ 4 天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 1 × 105~ 2 ×105個(gè)/ml 時(shí)，應(yīng)傳代培養(yǎng)至新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基中。

1.2.4 低溫儲(chǔ)存

⑴輕柔離心處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備細(xì)胞團(tuán)用于凍存。去除上清并將細(xì)胞團(tuán)重懸細(xì)胞凍存液中（如，500 μl 條件培養(yǎng)基：500 μl 新鮮培養(yǎng)基+ 50 ~ 100 μl DMSO），使得細(xì)胞最終密度為 5 × 106個(gè)/ml。

⑵將細(xì)胞懸液分裝至冷凍管，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行冷凍。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

單因素 ANOVA：兩兩比較檢驗(yàn)：一旦確定均值間存在差值，兩兩范圍檢驗(yàn)和成對(duì)多重比較就可以確定哪些均值存在差值。范圍檢驗(yàn)識(shí)別彼此間沒(méi)有差值的同類均值子集。成對(duì)多重比較檢驗(yàn)每一對(duì)均值之間的差分，并得出一個(gè)矩陣，其中星號(hào)指示在 0.05 的 α 水平上的組均值明顯不同。

Bonferroni 使用檢驗(yàn)在組均值之間執(zhí)行成對(duì)比較，但通過(guò)將每次檢驗(yàn)的錯(cuò)誤率設(shè)置為實(shí)驗(yàn)性質(zhì)的錯(cuò)誤率除以檢驗(yàn)總數(shù)來(lái)控制總體誤差率。這樣，根據(jù)進(jìn)行多個(gè)比較的實(shí)情對(duì)觀察的顯著性水平進(jìn)行調(diào)整。

Student-Newman-Keuls 使用學(xué)生化的范圍分布在均值之間進(jìn)行所有成對(duì)比較。還使用步進(jìn)式過(guò)程比較具有相同樣本大小的同類子集內(nèi)的均值對(duì)。均值按從高到低排序，首先檢驗(yàn)極端差分。

2 結(jié)果

2.1 MH677 細(xì)胞的生長(zhǎng)及表現(xiàn)

MH677 細(xì)胞在康寧 hybrigro SF?培養(yǎng)基及兩種無(wú)血清培養(yǎng)基中均實(shí)現(xiàn)細(xì)胞重組。相比于其他兩種已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的無(wú)血清培養(yǎng)基，MH677 細(xì)胞在 hybrigro SF?培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)更加旺盛，具有更高的細(xì)胞密度。并于培養(yǎng)的第4 天顯示出顯著差異（圖 1）。此外，相比于另外兩種無(wú)血清培養(yǎng)基，hybrigro SF?培養(yǎng)基中的細(xì)胞具有更高的 lgG2a生產(chǎn)能力，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 2）。

細(xì)胞生長(zhǎng)密度（× 106個(gè)/ml）2.0 1.5 1.0 0.5 0 1 2 3 4 時(shí)間（d）

lgG2a 產(chǎn)量（× 106 pg/細(xì)胞）2.0 1.5 1.0 0.5 0 hybrigro SF? 對(duì)照組 1 對(duì)照組 2

2.2 AE1 細(xì)胞的生長(zhǎng)及表現(xiàn)

AE1 細(xì)胞在康寧 hybrigro SF?培養(yǎng)基、兩種無(wú)血清培養(yǎng)基以及含有 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基中均實(shí)現(xiàn)細(xì)胞重組。AE1 細(xì)胞在 hybrigro SF?培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況不僅優(yōu)于已商業(yè)化生產(chǎn)的無(wú)血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)的第 4 天后，細(xì)胞密度甚至高于含血清的培養(yǎng)基的細(xì)胞密度，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 3）。此外，相比于其他無(wú)血清以及含血清培養(yǎng)基，hybrigro SF?培養(yǎng)基中的 AE1 細(xì)胞在第 4 天具有更高的總蛋白產(chǎn)量，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 4）。

細(xì)胞生長(zhǎng)密度（× 106個(gè)/ml）2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 1 2 3 4 時(shí)間（d）

lgG2a（× 105 ng）1.5 1.0 0.5 0 含10% FBS 的 hybrigro SF? 對(duì)照組DMEM

細(xì)胞活力 100090807060504030201004.00E + 06 3.50E + 06 3.00E + 06 2.50E + 06 2.00E + 06 1.50E + 06 1.00E + 06 0.50E + 06 0細(xì)胞數(shù)量 1 2 3 4 5 天數(shù)（d）

對(duì)比使用 hybrigro SF?培養(yǎng)基和常規(guī)含血清培養(yǎng)及進(jìn)行 AE1（ATCC HB-72?）細(xì)胞株培養(yǎng)。使用hybrigro SF?培養(yǎng)基的細(xì)胞株生長(zhǎng)更快，活力更高（圖 5）。

3 討論

hybrigro SF?培養(yǎng)基可用于細(xì)胞的直接適應(yīng)或者逐步適應(yīng)。盡管大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞并不需要進(jìn)行逐步適應(yīng)，所以逐步適應(yīng)被推薦用于目前使用的培養(yǎng)基與 hybrigro SF?培養(yǎng)基在成分上可能存在顯著差異的情況下進(jìn)行。

細(xì)胞成功進(jìn)行培養(yǎng)基適應(yīng)的重要因素包括：①細(xì)胞必須處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，適應(yīng)期前存活率在 90% 以上；②在適應(yīng)早期，推薦以較高的初始細(xì)胞接種量進(jìn)行接種，以提高條件培養(yǎng)基的攜帶量。

相比于其他兩種已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的無(wú)血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，MH677 及 AE1 細(xì)胞在 hybrigro SF?培養(yǎng)基中可獲得更高細(xì)胞密度。

相比于其同等的無(wú)血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，MH677 及 AE1 細(xì)胞在 hybrigro SF?培養(yǎng)基中可獲得更高產(chǎn)量的小鼠 lgG2a 抗體。

相比于添加了 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基，使用 hybrigro SF?培養(yǎng)基培養(yǎng) AE1 細(xì)胞時(shí)更易獲得高細(xì)胞密度及高蛋白產(chǎn)量。

hybrigro SF?培養(yǎng)基是雜交瘤細(xì)胞增殖和單克隆抗體生產(chǎn)的絕佳選擇。在沒(méi)有其他添加物的情況下，hybrigro SF?培養(yǎng)基不適用于膽固醇營(yíng)養(yǎng)缺陷的骨髓瘤衍生雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)（如：NS0、NS1 和 P3X63Ag8.653）。若進(jìn)行此類衍生細(xì)胞株的培養(yǎng)，需準(zhǔn)備含有可溶膽固醇的培養(yǎng)基添加物。

2014-07-10

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.015