韓文佳玥，朱明，柏瑋，何森健，張同存，孫媛霞

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

稀少糖是自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物。作為一種功能性甜味劑，稀少糖具有低熱量、低吸收、抗齲齒、降血糖、改善腸道菌群等理化性質(zhì)[1-4]。例如，D-阿洛酮糖可以改善腸道菌群、降低血糖、抗齲齒等[5-8]，D-阿洛糖具有抑制活性氧、抑制癌細(xì)胞增殖等功能[9-12]。因此，功能性稀少糖在膳食、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景。

2002年，Izumori教授建立了稀少糖的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)策略——Izumoring方法[13-14]。根據(jù)該方法利用酮糖差向異構(gòu)酶、醛糖異構(gòu)酶和多元醇脫氫酶可實(shí)現(xiàn)單糖與糖醇之間的相互轉(zhuǎn)化[15-18]。前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室建立了稀少糖轉(zhuǎn)化酶的篩選平臺(tái)，從各類環(huán)境樣品中篩選得到含有不同稀少糖轉(zhuǎn)化酶的微生物，并成功對(duì)其稀少糖轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行克隆、異源表達(dá)和性質(zhì)研究。例如，來源于瘤胃菌Ruminococcus sp.的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶 (D-psicose 3-epimerase, DPE)，可以將D-果糖轉(zhuǎn)化為 D-阿洛酮糖[19]；來源于枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis 168的 L-鼠李糖異構(gòu)酶(L-rhamnose isomerase, L-RhI)，可以將D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛糖[20]。

但是，DPE的轉(zhuǎn)化率普遍較低[19,21-24]，因此本研究提出利用雙酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)提高轉(zhuǎn)化效率的思路。即以D-果糖作為底物，利用DPE和L-RhI同時(shí)生產(chǎn) D-阿洛酮糖和 D-阿洛糖。由于D-阿洛糖的生成會(huì)消耗部分 D-阿洛酮糖，從而促進(jìn)整個(gè)反應(yīng)向生成功能性稀少糖的方向進(jìn)行，提高了底物的轉(zhuǎn)化率 (圖1)。

果葡糖漿、菊芋提取物中含有較高濃度的果糖，利用DPE、L-RhI雙酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化方法，以這些低附加值原料為底物，可以獲得含有 D-阿洛酮糖和 D-阿洛糖等功能性稀少糖的高附加值混合糖液，為利用酶法獲得含有功能性稀少糖的果糖高附加值產(chǎn)物的開發(fā)應(yīng)用提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生化試劑

圖1 雙酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的反應(yīng)Fig. 1 Reaction of dual enzyme-coupled system.

D-果糖、 D-阿洛酮糖、D-阿洛糖等稀少糖購自Sigma Aldrich。蛋白胨、酵母粉、瓊脂及其他試劑均為分析純。

1.1.2 菌種

異源表達(dá) DPE的菌種為 E. coli BL21 pET-RDPE，異源表達(dá) L-RhI的菌種為 E. coli BL21 pET-21a-L-RhI，均為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

E. coli的培養(yǎng)基為 Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 酶的表達(dá)與純化

分別將攜帶DPE和L-RhI基因的重組大腸桿菌接入含有終濃度為100 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至 OD600為0.8–1.0后，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，20 ℃、100 r/min繼續(xù)培養(yǎng)過夜。

培養(yǎng)結(jié)束后，10 000 r/min離心5 min收集菌體，棄去上清，菌體沉淀用破碎緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)懸浮，并在冰上超聲破碎細(xì)胞，然后于 4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清即為粗酶液。

將粗酶液經(jīng)過鎳離子親和層析柱純化目標(biāo)蛋白，所用純化系統(tǒng)為?KTA PurifierTM100 (GE Healthcare Biosciences)。將粗酶液經(jīng)0.45 μm的膜過濾后，上樣 His-Trap 鎳離子螯合柱(結(jié)合緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑，pH 8.0)，以高咪唑含量的緩沖液進(jìn)行線性洗脫(洗脫緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L 咪唑，pH 8.0)。收集目的蛋白洗脫峰，對(duì)于 DPE用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0)進(jìn)行脫鹽和濃縮，對(duì)于L-RhI用50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液 (pH 9.0)進(jìn)行脫鹽和濃縮，SDS-PAGE檢測(cè)純化所得蛋白的純度。

1.2.2 酶最佳比例的摸索

DPE、L-RhI雙酶偶聯(lián)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化D-果糖的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系為：以50 mmol/L Glycine-NaOH (pH 9.0)作為緩沖液，并添加1 mmol/L Mn2+，以2% D-果糖作為底物。DPE的加酶量為 0.05 mg/mL，L-RhI的加酶量分別為0.1、0.25、0.5 mg/mL，即兩酶的質(zhì)量比分別為1∶2、1∶5、1∶10。60 ℃下反應(yīng)至平衡。

在不進(jìn)位加法和進(jìn)位加法的口算測(cè)試中，各年級(jí)被測(cè)所用時(shí)間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差如表1所示．為了便于分．析，分別以add11、add12、jadd11、jadd12表示“一位數(shù)加一位數(shù)”、“一位數(shù)加兩位數(shù)不進(jìn)位加法”、“一位數(shù)加一位數(shù)進(jìn)位加法”和“一位數(shù)加兩位數(shù)進(jìn)位加法”．

1.2.3 最佳反應(yīng)溫度的摸索

以2% D-果糖作為底物，DPE和L-RhI的加酶量分別為 0.05 mg/mL和 0.5 mg/mL。在含有1 mmol/L Mn2+的50 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液(pH 9.0)中，不同溫度(30–70 )℃下反應(yīng)5 h，沸水浴5 min終止反應(yīng)，檢測(cè)D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的產(chǎn)率。

1.2.4 最佳反應(yīng)pH的摸索

以2% D-果糖作為底物，DPE和L-RhI的加酶量分別為 0.05 mg/mL和 0.5 mg/mL。在含有1 mmol/L Mn2+的不同pH (5.0–10.0)的緩沖液中(pH 5.0、6.0使用醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH 7.0、8.0使用Tris-HCl緩沖液，pH 9.0、10.0使用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)，60 ℃下反應(yīng)5 h，沸水浴5 min終止反應(yīng)，檢測(cè)D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的產(chǎn)率。

1.2.5 反應(yīng)進(jìn)程的測(cè)定

采用DPE、L-RhI雙酶偶聯(lián)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化D-果糖的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：利用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0)，以2% D-果糖作為底物，DPE和L-RhI的加酶量分別為0.05 mg/mL和0.5 mg/mL，60 ℃條件下反應(yīng)至平衡。以HPLC測(cè)定D-果糖、D-阿洛酮糖和 D-阿洛糖隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，繪制反應(yīng)進(jìn)程曲線。

1.2.6 糖的檢測(cè)

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的表達(dá)與純化

攜帶DPE和L-RhI基因的重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，均有蛋白表達(dá)，并且將菌體破碎后，發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物幾乎全部為可溶性蛋白，包涵體很少。

重組DPE和L-RhI蛋白經(jīng)過His Trap HP親和色譜一步純化后，即得到純度≥95%的電泳純的重組蛋白質(zhì) (圖2)。重組DPE和L-RhI蛋白的理論分子量分別約33 kDa和49 kDa，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果顯示，目的蛋白條帶大小符合預(yù)期。

RDPE的產(chǎn)量較高，每升發(fā)酵液產(chǎn)純酶約為150 mg，該酶對(duì)D-果糖的酶活為8.95 U/mg[19]；但L-RhI的產(chǎn)量較低，每升發(fā)酵液產(chǎn)純酶只有大約10 mg，該酶對(duì)D-阿洛酮糖的酶活為0.32 U/mg[20]。

2.2 酶最佳比例的摸索

采用DPE、L-RhI雙酶偶聯(lián)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化D-果糖的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，DPE和L-RhI的加酶質(zhì)量比分別為 1∶2、1∶5、1∶10。以 HPLC測(cè)定產(chǎn)物的組分以及各組分的含量，結(jié)果如表1所示。

圖2 DPE與L-RhI的純酶電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE analysis of DPE and L-RhI pure enzyme.

表1 不同加酶量時(shí)反應(yīng)液中各組分的含量Table 1 Content of sugars in reaction solution at different enzyme dosage

雙酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，L-RhI的加入轉(zhuǎn)化了部分的D-阿洛酮糖，使得DPE催化的反應(yīng)向生成 D-阿洛酮糖的方向移動(dòng)，從而提高了 D-果糖的轉(zhuǎn)化率。另外，由于在反應(yīng)體系中，DPE酶活較高，而L-RhI酶活較低，因此L-RhI是雙酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的限速酶，其加入量較低時(shí)需要很長的時(shí)間反應(yīng)才能達(dá)到平衡。

通過增加L-RhI的酶量，有助于D-阿洛糖的生成，當(dāng)DPE：L-RhI=1∶10 (W/W)，雙酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)達(dá)到平衡時(shí)，此時(shí)D-果糖與D-阿洛酮糖的質(zhì)量比約為 3∶1，D-阿洛酮糖與D-阿洛糖的質(zhì)量比約為 2∶1，分別為兩個(gè)酶催化反應(yīng)平衡時(shí)的底物與產(chǎn)物的比例。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，通過提高L-RhI添加的比例，可以彌補(bǔ)該酶活性和穩(wěn)定性較差的缺點(diǎn)。最終確定DPE和L-RhI加酶量的比例為 1∶10 (反應(yīng)體系中 RDPE的終濃度為0.05 mg/mL)。此時(shí)，產(chǎn)物的組成如圖3所示，除D-阿洛酮糖、D-阿洛糖以外，還有少量副產(chǎn)物出現(xiàn)。根據(jù)出峰時(shí)間推測(cè)該副產(chǎn)物應(yīng)為D-葡萄糖，是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間過長，D-果糖在L-RhI催化作用下發(fā)生異構(gòu)化，轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖。

2.3 雙酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)最佳條件的探索

2.3.1 反應(yīng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，隨著溫度的升高，D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的含量逐漸增加。這是因?yàn)殡S著溫度的升高，DPE和L-RhI的活性逐漸增強(qiáng)，在相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，果糖的轉(zhuǎn)化效率也隨之提高。但繼續(xù)提高反應(yīng)溫度會(huì)加速酶的失活，使反應(yīng)難以達(dá)到真正的平衡。實(shí)驗(yàn)表明：溫度大于60 ℃時(shí)，DPE的活性會(huì)逐漸下降，并且酶的熱穩(wěn)定性也逐漸降低[19]；而當(dāng)溫度分別為60 ℃、65 ℃、70 ℃和75 ℃時(shí)，反應(yīng)1 h，L-RhI的相對(duì)酶活比為 100:91:35:30。因此該反應(yīng)體系的最適反應(yīng)溫度確定為60 ℃。

圖3 反應(yīng)平衡時(shí)反應(yīng)液中各組分的HPLC分析Fig. 3 HPLC analysis of sugars in reaction solution at reaction equilibrium.

圖4 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 4 Effect of temperature on the conversion rate.

2.3.2 反應(yīng)pH對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，隨著反應(yīng)體系pH的升高，果糖轉(zhuǎn)化率逐漸提高，稀少糖的總量和D-阿洛糖的含量明顯增加。當(dāng)pH為9.0和10.0時(shí)，生成的D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的含量基本一致，且高于其他 pH下的產(chǎn)量。但是，當(dāng) pH為10.0時(shí)有副產(chǎn)物出現(xiàn)，而其他pH下幾乎沒有副產(chǎn)物出現(xiàn)。HPLC檢測(cè)和標(biāo)樣對(duì)比顯示該副產(chǎn)物可能為D-葡萄糖；Leang等報(bào)道來源于施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri的L-RhI可以催化D-葡萄糖和 D-果糖的相互轉(zhuǎn)化[25]，故推測(cè) pH較高時(shí)，L-RhI對(duì) D-果糖的活性變高，可以將D-果糖轉(zhuǎn)化為 D-葡萄糖。綜上所述，該反應(yīng)體系的最適pH確定為9.0。

圖5 pH對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 5 Effect of pH on the conversion rate.

2.4 雙酶偶聯(lián)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)程

以2%果糖作為底物測(cè)定DPE、L-RhI雙酶偶聯(lián)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)程曲線，結(jié)果如圖6所示。可見DPE催化的D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的反應(yīng)在很短的時(shí)間內(nèi)就達(dá)到平衡，1 h后D-阿洛酮糖的含量基本沒有明顯變化。而L-RhI的催化活性較低，反應(yīng)需經(jīng)歷較長的時(shí)間達(dá)到平衡。隨反應(yīng)進(jìn)行，D-阿洛糖的含量逐漸增加，D-果糖的含量小幅下降，大約10 h后反應(yīng)達(dá)到平衡。此時(shí)，D-果糖的含量約為 64%，比 DPE單酶反應(yīng)平衡時(shí)的轉(zhuǎn)化率有了較明顯的增加。

圖6 雙酶偶聯(lián)系統(tǒng)的反應(yīng)進(jìn)程Fig. 6 Reaction process of dual enzyme-coupled system.

3 結(jié)論

文中利用DPE和L-RhI構(gòu)建雙酶偶聯(lián)反應(yīng)體系，催化D-果糖生成D-阿洛酮糖和D-阿洛糖等功能性稀少糖。通過實(shí)驗(yàn)確定DPE和L-RhI加酶量的比例為 1∶10，其中 DPE 的濃度為0.05 mg/mL；轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最佳溫度為60 ℃，最佳pH為9.0。當(dāng)D-果糖濃度為2%時(shí)，經(jīng)過10 h反應(yīng)達(dá)到平衡，此時(shí) D-阿洛酮糖和 D-阿洛糖的產(chǎn)量分別為5.12和2.04 g/L。實(shí)驗(yàn)證明，多級(jí)反應(yīng)生物轉(zhuǎn)化，如酶的偶聯(lián)反應(yīng)，能夠更有效地將廉價(jià)底物單糖轉(zhuǎn)化為高附加值的稀少糖，可以作為功能性稀少糖開發(fā)應(yīng)用的研究基礎(chǔ)。

[1]Izumori K. Bioproduction strategies for rare hexose sugars. Naturwissenschaften, 2002, 89(3):120?124.

[2]Mu W, Zhang W, Feng Y, et al. Recent advances on applications and biotechnological production of D-psicose. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 94(6):1461?1467.

[3]Lu Y, Levin GV, Donner TW. Tagatose, a new antidiabetic and obesity control drug. Diabetes Obes Metab, 2008, 10(2): 109?134.

[4]Zeng Y, Zhang X, Guan Y, et al. Characteristics and antioxidant activity of Maillard reaction products from psicose-lysine and fructose-lysine model systems. J Food Sci, 2011, 76(3):C398?403.

[5]Chung MY, Oh DK, Lee KW. Hypoglycemic health benefits of D-psicose. J Agric Food Chem,2012, 60(4): 863?869.

[6]Hossain MA, Kitagaki S, Nakano D, et al. Rare sugar D-psicose improves insulin sensitivity and glucose tolerance in type 2 diabetes Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF)rats.Biochem Biophys Res Commun, 2011, 405(1):7?12.

[7]Hayashi N, Iida T, Yamada T, et al. Study on the postprandial blood glucose suppression effect of D-psicose in borderline diabetes and the safety of long-term ingestion by normal human subjects.Biosci Biotechnol Biochem, 2010, 74(3): 510?519.

[8]Ochiai M, Nakanishi Y, Yamada T, et al. Inhibition by dietary D-psicose of body fat accumulation in adult rats fed a high-sucrose diet. Biosci Biotechnol Biochem, 2013, 77(5): 1123?1126.

[9]Lim YR, Oh DK. Microbial metabolism and biotechnological production of D-allose. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 91(2): 229?235.

[10]Ishihara Y, Katayama K, Sakabe M, et al.Antioxidant properties of rare sugar D-allose:effects on mitochondrial reactive oxygen species production in Neuro2A cells. J Biosci Bioeng,2011, 112(6): 638?642.

[11]Tanaka S, Sakamoto H. Effects of D-allose on the endocytic activity of dendritic cells and the subsequent stimulation of T cells. Cell Immunol,2011, 271(1): 141?146.

[12]Murata A, Sekiya K, Watanabe Y, et al. A novel inhibitory effect of D-allose on production of reactive oxygen species from neutrophils. J Biosci Bioeng, 2003, 96(1): 89?91.

[13]Izumori K. Izumoring: a strategy for bioproduction of all hexoses. J Biotechnol, 2006, 124(4):717–722.

[14]Granstr?m TB, Takata G, Tokuda M, et al.Izumoring: a novel and complete strategy for bioproduction of rare sugars. J Biosci Bioeng,2004, 97(2): 89?94.

[15]Poonperm W, Takata G, Okada H, et al. Cloning,sequencing, overexpression and characterization of L-rhamnose isomerase from Bacillus pallidus Y25 for rare sugar production. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 76(6): 1297?1307.

[16]Uechi K, Takata G, Fukai Y, et al. Gene cloning and characterization of L-ribulose 3-epimerase from Mesorhizobium loti and its application to rare sugar production. Biosci Biotechnol Biochem,2013, 77(3): 511?515.

[17]Li Y, Zhu Y, Liu A, et al. Identification and characterization of a novel L-arabinose isomerase from Anoxybacillus flavithermus useful in D-tagatose production. Extremophiles, 2011, 15(3):441?450.

[18]Menavuvu BT, Poonperm W, Takeda K, et al.Novel substrate specificity of D-arabinose isomerase from Klebsiella pneumoniae and its application to production of D-altrose from D-psicose. J Biosci Bioeng, 2006, 102(5):436?441.

[19]Zhu Y, Men Y, Bai W, et al. Overexpression of D-psicose 3-epimerase from Ruminococcus sp. in Escherichia coli and its potential application in D-psicose production. Biotechnol Lett, 2012,34(10): 1901?1906.

[20]Bai W, Zhu Y, Men Y, et al. Bioconversion of D-fructose to D-allose by novel isomerases. Chin J Biotech, 2012, 28(4): 457?465 (in Chinese).柏瑋,門燕, 等. 以 D-果糖為原料利用新型異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn) D-阿洛糖. 生物工程學(xué)報(bào),2012, 28(4): 457–465.

[21]Mu W, Chu F, Xing Q, et al. Cloning, expression,and characterization of a D-psicose 3-epimerase from Clostridium cellulolyticum H10. J Agric Food Chem, 2011, 59(14): 7785?7792.

[22]Zhang L, Mu W, Jiang B, et al. Characterization of D-tagatose-3-epimerase from Rhodobacter sphaeroides that converts D-fructose into D-psicose. Biotechnol Lett, 2009, 31(6): 857?862.

[23]Kim HJ, Hyun EK, Kim YS, et al. Characterization of an Agrobacterium tumefaciens D-psicose 3-epimerase that converts D-fructose to D-psicose.Appl Environ Microbiol, 2006, 72(2): 981?985.

[24]Ishida Y, Kamiya T, Itoh H, et al. Cloning and characterization of the D-tagatose 3-epimerase gene from Pseudomonas cichorii ST-24. J Ferment Bioeng, 1997, 83(6): 529–534.

[25]Leang K, Takada G, Fukai Y, et al. Novel reaction of L-rhamnose isomerase from Pseudomonas stutzeri and its relation with D-xylose isomerase via substrate specificity. Biochim Biophys Acta,2004, 1674(1): 68–77.