許喬艷，韓瑞枝，李江華，堵國成，劉龍，陳堅

1 江南大學 糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

3 江南大學 糧食發(fā)酵工藝及技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122

維生素C (Vitamin C, VC)，又稱L-抗壞血酸 (L-Ascorbic Acid, L-AA)，是一種水溶性維生素。VC參與很多體內(nèi)生理活動，在保持和促進人體健康以及動物生長方面具有重要的作用[1-3]。VC用途很廣泛，可以作為酸味劑、還原劑、抗氧化劑、漂白劑和穩(wěn)定劑，廣泛應用于化妝品、食品和醫(yī)藥等行業(yè)中[4]。但VC本身極不穩(wěn)定，位于C2位置上的羥基很容易受pH、熱及Cu2+、Fe2+影響而發(fā)生氧化還原反應，導致其生理活性迅速減弱甚至消失，使其在應用上受到了很大的限制[5-7]。因此，為了提高VC的穩(wěn)定性，許多VC衍生物相繼出現(xiàn)，主要包括：VC金屬鹽，VC酯類以及糖基化VC[8-9]。由于VC糖基衍生物具有安全、穩(wěn)定性強、在體內(nèi)易降解產(chǎn)生L-AA等優(yōu)點，能更好地為人體和動物吸收和利用，因而更具優(yōu)勢。在所有的VC糖基衍生物中，以 2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗壞血酸(AA-2G)研究最多，應用最為廣泛，成為最理想的VC衍生物[7]。

AA-2G是利用糖基轉(zhuǎn)移酶特異性的轉(zhuǎn)糖基作用將糖基供體上的葡萄糖苷轉(zhuǎn)移到VC的C2上合成的。糖基轉(zhuǎn)移酶的選擇與使用是整個AA-2G合成中的重要環(huán)節(jié)，直接影響到AA-2G的合成效率[10]。目前報道過的糖基轉(zhuǎn)移酶有：α-葡萄糖苷酶[11]、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (CGT酶)[12]、淀粉酶[13]、蔗糖磷酸化酶[14]和 α-異麥芽糖基-吡喃葡糖形成酶[15]。其中來源于軟化類芽胞桿菌Paenibacillus macerans的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (CGT酶(EC2.4.1.19))因其催化生產(chǎn) AA-2G的高產(chǎn)物特異性而被認為是最優(yōu)選擇[16]。CGT酶是一種多功能型酶，能催化3種轉(zhuǎn)糖基反應 (歧化、環(huán)化和耦合反應)和水解反應[9,17]。它可以將一個或多個糖基供體環(huán)上的糖殘基α-1, 2糖苷鍵接于L-AA的C2原子上進行修飾得到 AA-2G(n)(“n”代表連接到L-AA上的糖基數(shù)量)，再由糖化酶的作用水解成AA-2G[18]。

研究發(fā)現(xiàn)以環(huán)糊精為糖基供體時，產(chǎn)物專一性比較高，但是以α-環(huán)糊精為糖基供體，成本太高；以β-環(huán)糊精為糖基供體，由于β-環(huán)糊精的溶解度較低，酶促反應效率受到較大限制，均不適用于 AA-2G大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[16,19]。因此，以價格低廉且易溶的麥芽糊精為糖基供體高度專一性地合成AA-2G具有重要意義。X-射線衍射研究表明 CGT酶表面存在一個明顯的底物結(jié)合凹槽，在底物結(jié)合凹槽中存在9個亞位點，標記為+2～–7，每個亞位點能結(jié)合一個葡萄糖殘基[20]。在之前的研究中，我們已經(jīng)對–3亞位點附近的氨基酸殘基進行定點突變并獲得較理想的結(jié)果，說明–3亞位點是改善CGT酶對麥芽糊精的底物特異性的有效位點[21]。前期研究發(fā)現(xiàn)+1亞位點亦是CGT酶催化轉(zhuǎn)糖基的關(guān)鍵位點[22]。本研究中，我們對+1亞位點附近涉及的氨基酸殘基：Leu194、Ala230和His233進行定點飽和突變，旨在考察亞位點+1處突變對CGT酶以麥芽糊精為糖基供體特異性合成AA-2G的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

P. macerans JFB05-01系本研究室從淀粉生產(chǎn)企業(yè)附近的土壤中篩選獲得，菌種保藏在國家典型微生物保藏中心 (保藏號：CCTCC M203062)；克隆宿主菌E. coli JM109和表達宿主菌E. coli BL21(DE3)由本實驗室保藏。克隆質(zhì)粒 pMD19T-simple和表達質(zhì)粒 pET-20b(+)購自大連寶生物工程有限公司；重組質(zhì)粒pET-20b(+)/cgt由本實驗室構(gòu)建并保藏(GenBank Accession No. AF047363)。

1.1.2 酶和試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒、氨芐青霉素及麥芽糊精 (DE15-20)購自上海生工生物工程公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、定點突變試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq酶、PrimerStarDNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司。AA-2G購自日本林原生化研究所，L-AA購自江蘇江山制藥有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基LB、TB均按Invitrogen公司操作手冊方法配制。

1.2 方法

1.2.1 突變質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

以質(zhì)粒pET-20b(+)/cgt為模板，設計引物，采用突變試劑盒一步PCR法對CGT酶 +1亞位點附近的氨基酸殘基 (Leu194、Ala230、His233)進行定點飽和突變。以第一輪突變的產(chǎn)物為模板進行兩點和三點復合突變。Leu194、Ala230、His233定點飽和突變及復合突變的引物見表1。

表1 定點突變引物Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis

PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)定點突變試劑盒處理轉(zhuǎn)化E. coli JM109，挑取陽性克隆，送上海生物工程有限公司測序。將鑒定正確的突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化表達宿主E. coli BL21 (DE3)，得到含有突變質(zhì)粒的基因工程菌。

1.2.2 突變體的生產(chǎn)與純化

種子培養(yǎng)：將含突變質(zhì)粒的 E. coli BL21(DE3)接入裝有20 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，回旋式搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)8 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按4% (V/V)的接種量，接種至裝有100 mL TB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中進行培養(yǎng)，開始培養(yǎng)溫度為 37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速 200 r/min，當菌體培養(yǎng)至OD600為0.6時，添加IPTG至0.01 mmol/L，迅速轉(zhuǎn)至25 ℃搖床，繼續(xù)誘導90 h。

各培養(yǎng)基使用前添加100 μg/mL氨芐青霉素。

含有突變質(zhì)粒的基因工程菌培養(yǎng)90 h后的發(fā)酵液在8 000 r/min、4 ℃下離心15 min，除去菌體，得上清即粗酶液。所有飽和突變體粗酶液的純化均采用Ni柱一步親和層析法[5]。

1.2.3 AA-2G的合成與檢測

將純化后的酶液用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)稀釋至蛋白濃度為1 mg/mL，取適量與底物麥芽糊精和L-AA (5%, W/V)混合，以2 mL甘油管作為反應容器，基本裝滿，黑色紙包裹避光避氧下37 ℃反應24 h，然后加入10 U/mL糖化酶在65 ℃、pH 5.5條件下反應24 h，通過HPLC方法檢測AA-2G產(chǎn)量。

HPLC檢測AA-2G產(chǎn)量方法：酶反應樣品通過0.22 μm濾膜過濾，使用Amethyst C18-H柱 (4.6 mm×250 mm, Sepax, America)檢測。檢測波長：238 nm；流動相：0.05 mol/L KH2PO4/H3PO4(pH 2.0)；流速：0.6 mL/min。在此條件下，在大約10 min時會出現(xiàn)AA-2G的流出峰。AA-2G濃度通過峰面積計算而得。

在初始轉(zhuǎn)化條件 (37 ℃，pH 5.5)的基礎(chǔ)上，考慮不同反應溫度(20 ℃、28 ℃、36 ℃、44 ℃和52 ℃)和 pH (醋酸-醋酸鈉緩沖液：pH 4.0、4.5、5.0、5.5和6.0；磷酸緩沖液：pH 6.0、6.5、7.0和8.0）對野生型/突變型CGT酶合成AA-2G的影響。

將野生型(突變型)CGT酶與不同濃度的麥芽糊精(0.23、0.46、1.16、2.3、11.6和23.2 mmol/L)和 L-AA (2.83、5.67、28.3、56.7 和 141.5 mmol/L)混合反應測定AA-2G合成的動力學參數(shù)。采用SigmaPlot (Jandel Scientific)擬合數(shù)據(jù)，得到下面的公式：

乒乓(Ping-Pong)反應機制：

底物抑制反應機制：

其中：v為不同底物濃度下的反應速率 (每毫克酶每小時催化生成AA-2G的量，mmol/(L·mg·h))；Vmax為反應的最大速率(mmol/L·mg·h)；a 和 b 分別為糖基供體 (麥芽糊精)和受體 (L-AA)的濃度 (mmol/L)；KmA和KmB分別為底物麥芽糊精和L-AA的親和常數(shù)；KiB為底物L-AA的抑制常數(shù)。

1.2.4 酶活測定

甲基橙法測定 α-環(huán)化活力的方法[23]：取適當稀釋的酶液0.1 mL，加入裝有0.9 mL預先用50 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 6.5)配制的3%可溶性淀粉溶液中，在40 ℃下反應10 min后，加入1.0 mL 1.0 mol/L的鹽酸停止反應，再加入1.0 mL用 50 mmol/L磷酸緩沖液配制的0.1 mmol/L甲基橙，在16 ℃下保溫20 min，在505 nm下測定吸光度。一個酶活單位定義在該條件下每分鐘生成1 μmol α-環(huán)糊精所需酶量。

淀粉水解活力測定方法[9]：將適量的酶液加入到含2%可溶性淀粉的50 mmol/L磷酸緩沖液中 (pH 6.5)，50 ℃反應10 min，然后用DNS法測定還原糖濃度。一個酶活單位定義在該條件下每分鐘生成1 μmol還原糖所需酶量。

歧化反應活力測定方法[9]：將含有6 mmol/L供體底物 4-硝基苯基-α-D-麥芽庚糖-4-6-O-亞乙基 (EPS)和 10 mmol/L受體底物麥芽糖的10 mmol/L檸檬酸緩沖液 (pH 6.0)在50 ℃保溫10 min中，然后加入適當稀釋的酶液0.1 mL反應，每0.5 min 取100 μL 反應樣品加入20 μL 1.2 mol/L HCl (4 ℃)，然后在60 ℃保溫10 min使CGTase失活。隨后，加入 20 μL 1.2 mol/L NaOH中和，將樣品加到磷酸緩沖液 (pH 7.0)，并加入 60 μL (1 U)α-糖苷酶于 37 ℃反應60 min。加入1 mL 1 mol/L碳酸鈉使樣品pH升至 8以上，在 401 nm波長下側(cè)吸光值(ε401=18.4 mmol/L)。1單位酶活定義為每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol的酶的量。

1.2.5 突變體的晶體結(jié)構(gòu)模擬

野生型 (突變型)CGT酶的理論晶體結(jié)構(gòu)通過SWISS-MODEL蛋白模擬在線服務器 (http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html[24])進行同源模擬獲得，模板為來源于B. circulans 251的CGT酶 (PDB編碼：1CXK)[25]。理論結(jié)構(gòu)與模板具有68.4%的同源性，序列對比顯示僅在249位的氨基酸存在差異。所有分子結(jié)構(gòu)圖形均由Accelrys Discovery Studio Client 2.5軟件制作。通過組合擴展方法 (http://cl.sdsc.edu/[26])進行結(jié)構(gòu)比對，對模型進行PROCHECK[27]、Verify3D[28]和ProQ[29]分析，發(fā)現(xiàn)有 95%的殘基位于理想?yún)^(qū)域，僅 0.2%位于未知區(qū)域。模型與模板之間的根均方偏差 (RMSD)也由組合擴展方法[26]計算而得，發(fā)現(xiàn)模型與模板的外觀結(jié)構(gòu)十分相似 (通過Cα原子最小二乘法原則進行疊加，RMSD為0.5 ?)。麥芽九糖抑制劑由模板PDB 1CXK的活性位點轉(zhuǎn)移至模型的活性位點。最后，酶-底物反應的能量由Accelrys Discovery Studio Client 2.5提供的Amber-based能量最小化方法計算獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的AA-2G合成

所有的突變體均由定點突變技術(shù)成功構(gòu)建并經(jīng)DNA測序鑒定正確。將野生型和飽和突變獲得的所有突變型CGT酶經(jīng)E. coli BL21 (DE3)表達，SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)表達水平及分子量均無明顯變化。粗酶液經(jīng)Ni-柱純化，得到電泳純蛋白。

在構(gòu)建的所有單點突變體中，突變體L194N、A230D、H233E相較于野生型CGT酶產(chǎn)AA-2G的量最高 (其他單點突變體產(chǎn) AA-2G的量均低于野生型CGT酶或提高率在10%以下)。在這3株優(yōu)勢突變體的基礎(chǔ)上，我們再進行兩點和三點復合突變，得到L194N/A230D、L194N/H233E、A230D/H233E和L194N/A230D/H233E四株復合突變體。其中，三點復合突變體L194N/A230D/H233E以麥芽糊精為糖基供體產(chǎn)AA-2G的量最高為1.95 g/L，較野生型提高了62.5% (表2)。

2.2 突變體酶法合成 AA-2G的最適溫度和最適pH

野生型 (突變型)CGT酶以麥芽糊精為糖基供體合成AA-2G的最適反應溫度為36 ℃，與α-CGT酶催化以β-環(huán)糊精為底物合成AA-2G的最適反應溫度一致[18]，而重組α-CGT酶催化環(huán)化反應的最適溫度為45 ℃[23]。在20–52 ℃的范圍內(nèi)，野生型CGT酶催化合成AA-2G的能力變化不大。當溫度升高至44 ℃時，突變體產(chǎn)AA-2G的量下降較快，52 ℃時突變體催化合成AA-2G的產(chǎn)量降至36 ℃時的一半左右 (圖1)。

表2 野生型 (突變型)CGT酶的相對酶活和AA-2G產(chǎn)量Table 2 Comparison of the reaction activities and AA-2G yields of the wild-type and mutant CGTases

圖1 反應溫度對野生型(突變型)CGT酶以麥芽糊精為糖基供體合成AA-2G的影響Fig. 1 Effect of reaction temperature on AA-2G synthesis by the wild-type and mutant CGTases with maltodextrin as the glycosyl donor.

圖 2反映了不同 pH對野生型 (突變型)CGT酶催化合成 AA-2G的影響。與野生型相比，突變體的最適反應 pH有一定程度上的變化。其中，突變體L194N、L194N/A230D與野生型一致，催化合成AA-2G的最適pH為6.5；而突變體 A230D、H233E、L194N/H233E、A230D/H233E和 L194N/A230D/H233E則在pH 7.0時獲得最高的AA-2G產(chǎn)量。初步推測，突變體引入的不同極性的氨基酸可能改變了底物結(jié)合活性位點可解離基團的 pKa，進而造成最適反應pH的改變。

圖3為在最適溫度和最適pH條件下，野生型和突變型CGT酶催化合成AA-2G產(chǎn)量隨時間的變化曲線。在反應的初始階段，AA-2G的產(chǎn)量有明顯的增長，野生型和突變體均在 24 h時獲得AA-2G 的最高產(chǎn)量 (表 2)。在所有突變體中，L194N/A230D/H233E的產(chǎn)量最高，約為野生型的1.6倍。

圖2 反應pH對野生型 (突變型)CGT酶以麥芽糊精為糖基供體合成AA-2G的影響Fig. 2 Effect of reaction pH on AA-2G synthesis by the wild-type and mutant CGTases with maltodextrin as the glycosyl donor.

圖3 野生型 (突變型)CGT酶以L-AA和麥芽糊精為底物合成AA-2G的時間產(chǎn)量曲線Fig. 3 Time profiles of AA-2G synthesis by the wild-type and mutant CGTases with L-AA and maltodextrin as the substrates.

圖4 野生型CGT酶(a)和突變體L194N/A230D/H233E (b)合成AA-2G反應的Lineweaver-Burk曲線Fig. 4 Lineweaver-Burk plots of the AA-2G synthesis by the wild-type CGTase (A)and the mutant L194N/A230D/H233E (B). L-AA concentrations (mmol/L): ■: 2.83; ●: 5.67; ▲: 28.3; ◆: 56.7; ★: 141.5. Linear regression of the experimental data is represented by black dotted lines, and the calculated values from Equation (1)and(2)are represented by red solid lines.

2.3 突變體的反應動力學及作用機理分析

為了研究野生型 (突變型)CGT酶的動力學性質(zhì)，分別測定了以不同濃度的麥芽糊精和L-AA為底物時 AA-2G的產(chǎn)量。擬合數(shù)據(jù)并對野生型CGT酶及突變體 L194N/A230D/H233E進行Lineweaver-Burk作圖，得到圖4。如圖4A所示，對野生型CGT酶進行動力學分析，經(jīng)雙倒數(shù)線性擬合得到的直線符合多底物酶促反應的乒乓機制，與公式(1)計算的值相符合；而突變體L194N/A230D/H233E線性擬合的結(jié)果與公式(2)計算的值較符合，說明其酶促反應符合底物抑制動力學模型，高濃度的底物L-AA對AA-2G的合成存在抑制作用 (圖4B)。另外幾個突變體的分析結(jié)果也符合公式(2)，詳細的動力學參數(shù)見表3。

突變體的最大反應速率 (Vmax)要高于野生型，Km(麥芽糊精)和Kcat/Km(麥芽糊精)值的變化顯示出突變體對底物麥芽糊精的親和性和酶促反應的催化效率與野生型相比都有一定程度的提高。突變體相對于野生型 Km(L-AA)和 Kcat/Km(L-AA)值的變化則說明突變體對底物 L-AA的親和性有所降低。抑制常數(shù)Ki(L-AA)表明高濃度的L-AA對突變體K47L/Y89F/N94P/D196Y催化的的酶促反應抑制作用最顯著。

我們還考察了突變對 CGT酶 α-環(huán)化活力、淀粉水解活力及歧化活力的影響。如表2所示，突變型 CGT酶的 α-環(huán)化活力降至野生型的一半甚至更低，而除突變體L194N和A23D/H233E的淀粉水解活力較野生型分別降低了18.2%和6.1%外，大部分突變型CGT酶的淀粉水解活力均有一定程度的提高。突變體L194N、A230D、H233E、L194N/A230D、L194N/H233E、A230D/H233E和L194N/A230D/H233E的歧化反應活力較野生型CGT酶分別提高了15.6%，25.8%，27.5%，40.2%，47.5%，58.3%和62.5%。這一增長趨勢與AA-2G產(chǎn)量的趨勢一致，說明歧化反應是以麥芽糊精做為糖基供體生產(chǎn)AA-2G的關(guān)鍵反應。

圖5A–D依次為野生型CGT酶和第94位亮氨酸，第230位丙氨酸和第 233位組氨酸分別被天冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酸取代的突變體，可以看出突變體與野生型CGT酶的氨基酸側(cè)鏈有很大的差別。

如圖5B，CGT酶第194位的氨基酸由亮氨酸突變?yōu)樘於０?，使?cè)鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，進而引發(fā)了附近的氨基酸殘基及整個空間結(jié)構(gòu)的變化，可能在一定程度上改善了CGT酶與線性底物麥芽糊精間的結(jié)合，提高了AA-2G的合成效率。

如圖5C所示，CGT酶第230位的丙氨酸突變?yōu)樘於彼岷?，與底物分子間的氫鍵作用力較突變前有所增強。增加的氫鍵使底物分子更趨向于第 230位的氨基酸殘基，可能在一定程度上阻滯了線性底物的環(huán)化，造成突變體A230D環(huán)化活力的大幅度降低。然而增強的氫鍵作用力也可能有效改善了突變體A230D對線性底物(如麥芽糊精)的親和性，更利于其以麥芽糊精為糖基供體合成更高產(chǎn)量的 AA-2G。突變體H233E底物特異性改善的機理與突變體A230D類似 (圖 5D)。相關(guān)動力學參數(shù) Km(麥芽糊精)和Kcat/Km(麥芽糊精)的變化也證實了這一點。

圖5 野生型 (突變型)CGT酶與麥芽九糖抑制劑在+1亞位點上作用的模擬結(jié)構(gòu)圖Fig. 5 Close-up the wild-type and mutant CGTases theoretical structure with a maltononaose substrate at subsite +1 (PDB accession code 1CXK). (A)Wild-type CGTase. (B)L194N. (C)A230D. (D)H233E.

表3 野生型 (突變型)CGT酶的動力學參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of the wild-type and mutant CGTases

3 結(jié)論

本實驗通過定點突變技術(shù)構(gòu)建了 7株底物麥芽糊精特異性明顯改善的CGT酶突變體，其中三點突變體L194N/A230D/H233E以麥芽糊精為底物合成AA-2G的產(chǎn)量最高為1.95 g/L，較野生型CGT酶提高62.5%。通過動力學分析和晶體結(jié)構(gòu)模擬我們初步闡述了突變體底物麥芽糊精特異性改善的機理。研究結(jié)果使我們進一步了解了+1亞位點附近氨基酸殘基的突變能有效提高CGT酶與線性底物分子的親和性。為了進一步提高AA-2G的產(chǎn)量，還需繼續(xù)開展CGT酶的固定化和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化等工作。

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