糖尿病大鼠外周血管病變中結(jié)締組織生長因子的表達(dá)及其意義

楊 靜, 姜會(huì)慶

糖尿病大鼠外周血管病變中結(jié)締組織生長因子的表達(dá)及其意義

楊 靜, 姜會(huì)慶

目的初步探討結(jié)締組織生長因子在糖尿病外周血管病變發(fā)生過程中的作用。方法24只健康SD大鼠隨機(jī)分成糖尿病組(A組)和對照組(B組)。 A組腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型；12周后處死，取雙側(cè)股動(dòng)脈HE染色觀察管壁病變情況，免疫組織化學(xué)染色檢查CTGF在血管壁中的表達(dá)情況，電鏡觀察血管壁的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果①HE染色：血管管腔面積與血管外截面面積之比(ST),A組較B組降低(P<0.05)血管壁厚度與血管外徑之比(WT)，A組較B組增加(P<0.05)，提示A組管腔狹窄，血管順應(yīng)性降低。②免疫組化染色：A組CTGF表達(dá)呈陽性(+)，并主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)；而B組大鼠外周血管CTGF表達(dá)基本呈陰性(-)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。③電鏡觀察：A組血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞腫脹變形，體積增大，胞漿豐富，內(nèi)有發(fā)達(dá)的細(xì)胞器，以增生的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體為主，血管基底膜增厚。結(jié)論STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠外周血管在病程12周時(shí)出現(xiàn)了明顯的病理變化，包括動(dòng)脈管腔狹窄、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)增生及血管基底膜增厚；同時(shí)，CTGF在內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)出現(xiàn)顯著增強(qiáng)，提示血管病變可能與CTGF表達(dá)增加有關(guān)。

糖尿??； 鏈脲佐菌素； 外周血管病變； 結(jié)締組織生長因子

糖尿病外周血管病變(peripheral vascular lesions, PVL)是糖尿病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，最常見于下肢血管，發(fā)病率為正常人群的4倍。據(jù)Walters等[1]報(bào)道，Ⅰ型糖尿病患者并發(fā)外周血管病變的發(fā)生率為8.7%，Ⅱ型糖尿病患者并發(fā)外周血管病變的發(fā)生率為23.5%。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)是1988年由Almendral等[2]首先在小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種生長因子，被視為轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)的下游反應(yīng)元件，主要由成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌，它能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞有絲分裂，趨化細(xì)胞、誘導(dǎo)黏附、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)產(chǎn)生。在皮膚、肺、腎等器官的纖維化過程中表達(dá)明顯增強(qiáng)[3]。2009年，筆者通過觀察STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠外周血管病變中結(jié)締組織生長因子的表達(dá)與血管病變的情況，探討CTGF在糖尿病PVL發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及意義，了解PVL的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 健康清潔級(jí)雌性SD大鼠24只，3個(gè)月齡，體質(zhì)量(150±20) g，由中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ；美國SIGMA公司)，快速血糖試紙(美國強(qiáng)生公司)，兔抗鼠CTGF單克隆抗體(美國 SANTA CRUZ 公司)，超敏SP試劑盒及DAB顯色試劑盒(南京宇盛達(dá)實(shí)業(yè)有限公司)，鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。

1.2 STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型制作 將24只大鼠隨機(jī)分成2組：糖尿病組(A組，n=12)和對照組(B組，n=12)。禁食10 h后，分別測定兩組大鼠體質(zhì)量及空腹血糖值，按STZ 60 mg/kg(60 ml/kg)空腹體質(zhì)量的劑量，一次性向A組大鼠腹腔內(nèi)注射STZ。B組大鼠僅給予0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，腹腔注射60 ml/kg空腹體質(zhì)量。用藥72 h后大鼠尾靜脈采血測血糖，以隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L且能維持1周以上，確定為糖尿病大鼠模型建立標(biāo)準(zhǔn)。不能達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)者，72 h后補(bǔ)注STZ(以15 mg/kg空腹體質(zhì)量劑量，腹腔內(nèi)注射)。STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠成模后，每2周稱量大鼠體質(zhì)量，測隨機(jī)血糖，對不能達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)的大鼠和死亡大鼠，及時(shí)排除實(shí)驗(yàn)組并予以補(bǔ)充。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.3 取材及標(biāo)本處理 STZ誘導(dǎo)成模后12周，稱量大鼠體質(zhì)量，測隨機(jī)血糖，禁食12 h后，以10%鹽酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔內(nèi)注射，麻醉生效后立即處死大鼠，并迅速于大鼠雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)上方1.0 cm至股動(dòng)脈起始處切取股動(dòng)脈，取該段股動(dòng)脈中段，長約0.5 cm的血管，常規(guī)HE染色、免疫組織化學(xué)染色及電鏡觀察。

1.4 組織病理學(xué)觀察 ①數(shù)據(jù)采集。顯微鏡下觀察標(biāo)本血管病理改變情況，測量血管內(nèi)、外周長，計(jì)算血管內(nèi)(r)、外半徑(R)及血管截面積(S)和管腔面積(s)，并由此計(jì)算血管壁厚度與血管外徑之比(WT,%)及管腔面積與血管截面積之比(ST,%)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。②免疫組化染色光鏡下觀察。陽性細(xì)胞為棕黃色著色，結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度兩個(gè)方面，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的分析。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)包括血管內(nèi)膜及平滑肌層全層的高倍視野(×400)，對陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值再結(jié)合染色強(qiáng)度，作為該標(biāo)本的陽性染色結(jié)果，(-)為未見陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞數(shù)<30%，陽性染色弱；(+)為陽性細(xì)胞數(shù)≥30%，陽性染色強(qiáng)。③電鏡下觀察。在透射電鏡下觀察超薄切片(×106)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞變化情況及基底膜厚度改變。

2 結(jié)果

A組較B組血管管腔狹窄，管壁增厚，差異顯著。染色結(jié)果：A組出現(xiàn)管腔狹窄、內(nèi)膜皺褶；平滑肌細(xì)胞胞核及胞漿淡染，核周出現(xiàn)空泡樣改變，細(xì)胞肥大，胞漿豐富，基底膜增厚明顯，血管壁較對照組增厚(圖1a)。B組動(dòng)物的股動(dòng)脈HE染色顯示，組織結(jié)構(gòu)正常，血管壁較薄，血管基底膜較薄(圖1b)。

數(shù)據(jù)測定：HE染色的切片顯微鏡下拍照，因血管為空腔臟器，面積可因擠壓、塌陷等原因發(fā)生改變，而血管周徑相對恒定，因此，選擇人工定位血管周徑，計(jì)算機(jī)測量血管內(nèi)、外周徑(L，l)，計(jì)算出血管管腔面積、血管外橫截面面積(S、s)。根據(jù)測量結(jié)果，計(jì)算管腔面積與血管外截面面積之比(ST)，兩組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行方差分析(表1)。

圖1 兩組大鼠股動(dòng)脈形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(HE ×40) a. A組股動(dòng)脈：血管管徑狹窄，血管壁明顯增厚 b. B組股動(dòng)脈：血管形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，血管壁較薄

Fig1 Changes of femoral arteries in two group of rats (HE ×40).

a. the femoral artery with narrowed vessel and thickened vessel wall.b. the normal femoral artery with thinner vessel wall in group B.

A組較B組血管壁中有明顯CTGF的表達(dá)，差異顯著。對免疫組織化學(xué)染色，染色陽性信號(hào)為棕黃色顆粒，主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的胞漿區(qū)，陰性對照無棕黃色著色。觀察發(fā)現(xiàn)，12周時(shí)B組偶可見少量散在棕黃色著色，大部分檢查結(jié)果為陰性；A組血管壁中有明顯CTGF的表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞胞漿區(qū)可見大量棕黃色陽性著色區(qū)，大部分檢查結(jié)果為陽性。對染色結(jié)果進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，A組與B組比較P<0.01，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。CTGF免疫組化染色陰性對照。

A組血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變：電鏡下觀察B組血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無明顯改變；A組血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞腫脹變形，體積增大，胞漿豐富，內(nèi)有發(fā)達(dá)的細(xì)胞器，以增生的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體為主，血管基底膜增厚，提示合成、分泌活躍。

表1 兩組大鼠股動(dòng)脈ST和WT的比較

注:與B組相比較，*P<0.01,**P<0.05

表2 兩組大鼠股動(dòng)脈免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的比較

Tab 2 Comparison of IHC results in the two groups n=12

注：P<0.01

3 討論

引起糖尿病血管損傷的機(jī)制有很多，通過對糖尿病腎病及糖尿病性視網(wǎng)膜病變的研究[4-5]證實(shí)，高血糖通過激活蛋白激酶C(PKC)，增加TGF-β的產(chǎn)生，可以導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增加，血管基底膜增厚，引起血流障礙。作為TGF-β的下游因子，結(jié)締組織生長因子是一個(gè)重要的促組織纖維化蛋白，在TGF-β刺激下成纖維細(xì)胞能夠長時(shí)間產(chǎn)生高水平的CTGF，直接或間接增強(qiáng)纖維連接蛋白、各型膠原和整合素等ECM成分的產(chǎn)生[6]，而利用CTGF中和抗體卻能夠明顯減輕TGF-β所誘導(dǎo)的膠原合成[7]。Wang等[8]通過研究證實(shí)，應(yīng)用CTGFsiRNA可有效抑制TGF-β1介導(dǎo)的豬成纖維細(xì)胞的CTGF及ECM的表達(dá)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)提示我們，如能阻抑CTGF表達(dá)將有望阻斷或減少由TGF-β過表達(dá)導(dǎo)致血管基底膜的增厚，從而阻止或減緩糖尿病外周血管病變的發(fā)生及發(fā)展。

正常組織內(nèi)各種管腔內(nèi)皮細(xì)胞均可產(chǎn)生CTGF，且CTGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞呈原位表達(dá)，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、增殖、遷移，并呈劑量依賴性。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的功能，主要是通過收縮和舒張來維持血管壁的張力，通過增生和產(chǎn)生ECM來維持血管的完整性，其增殖、遷移可導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成，這在血管損傷修復(fù)形成和發(fā)展的過程中起到了關(guān)鍵性的作用[9]。2008年，有學(xué)者通過下調(diào)CTGF表達(dá)，抑制了VSMC的增殖和遷移[10]，證實(shí)了CTGF對VSMC的作用。研究者們通過RNA干擾靶向抑制了CTGF后發(fā)現(xiàn),血管平滑肌細(xì)胞分泌下游纖維化因子的過程被阻抑，有效干預(yù)了血管纖維化的過程[11]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)， CTGF在誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化和鈣化中，發(fā)揮了重要作用，可能通過誘導(dǎo)VSMC轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞而促進(jìn)血管鈣化[12]。在本次實(shí)驗(yàn)中，A組血管壁中有明顯CTGF的表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞胞漿區(qū)可見大量棕黃色陽性著色區(qū)，提示CTGF在細(xì)胞內(nèi)呈過表達(dá)。電鏡結(jié)果顯示，正是在上述區(qū)域內(nèi)血管壁出現(xiàn)了明顯病理性改變。

本研究中，我們以STZ腹腔注射SD大鼠，成功建立糖尿病模型。在病程12周時(shí)光學(xué)顯微鏡及電鏡下呈現(xiàn)明顯外周血管病變，管壁粗糙，管腔狹窄，血管內(nèi)皮皺褶，內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增生和(或)肥大及ECM沉積、基底膜增厚，說明糖尿病外周血管病變已發(fā)生，且免疫組化顯示，CTGF在上述病理改變部位即血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)明顯增高。目前的研究顯示,CTGF在糖尿病腎病早期即出現(xiàn)表達(dá)明顯增高[13]，且在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變中，CTGF的產(chǎn)生早于微循環(huán)血管的改變[14]。上述研究結(jié)果提示，CTGF有可能在早期通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化及促進(jìn)ECM的產(chǎn)生等途徑，參與了糖尿病外周血管病變發(fā)生及發(fā)展過程。CTGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可能是糖尿病外周血管病變發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。但其具體作用機(jī)制及能否通過阻斷CTGF途徑來改善糖尿病外周血管病變的發(fā)生、發(fā)展，尚有待進(jìn)一步研究。

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Expressionofconnectivetissuegrowthfactorintheperipheralvascularlesionsofdiabeticratanditssignificance

YANGJing,JIANGHui-qing.

(DepartmentofBurnandPlasticSurgery,AnhuiSecondProvincialPeople′sHospital,Hefei230011,China)

ObjectiveTo observe the effect of connective tissue growth factor (CTGF) on the development of peripheral vascular lesions of diabetes.MethodsTwenty-four Sprague-Dawley rats were divided randomly into Diabetes Mellitus group (A,n=12) and Normal Control group (B,n=12). Streptozotocin was injected intraperitoneally into the rats in group A to establish the model of diabetic rats. At the 12th week, the rats were sacrificed and their femoral artery were harvested. HE stain, immunohistochemistry stain and electron microscope were applied to observe the pathologic structure, the expression of CTGF and ultrastructure of femoral artery, respectively.Results①HE staining: the ratio of the area of vessel lumen and that of whole vessel in group A was obviously lower than that in group B (P<0.05). Accordingly, the ratio of the thickness of vessel wall and the radius of whole vessel in group A was obviously higher than that in group B (P<0.05). These results suggested that the vessel lumen in group A became stenotic and the vessel compliance decreased. ②Immunohistochemistry staining: In group A, CTGF was expressed in vascular endothelial cells and smooth muscle cells. In group B, the expression of CTGF was almost absent. The difference was much significant (P<0.01). ③Electron microscope: Swelling, enlargement, deformity and hyperplasia of cytoplasm and endoplasmic reticulum were observed in both endothelial cells and smooth muscle cells. The basement membrane also became thick.ConclusionEvident peripheral vascular lesions were observed in streptozotocin-induced diabetic rats, described as follows: Stenosis of vessel lumen, impairment of vascular endothelial cells, hypertrophy of smooth muscle cells, hyperplasia of extra cellular matrix and thickening of basement membrane, at the same time, the expression of CTGF in group A was obviously elevated, which suggested the possible relation between the peripheral vascular lesions and the expression of CTGF.

Diabetes mellitus; Streptozotocin; Peripheral vascular lesions; Connective tissue growth factor

230011 安徽 合肥,安徽省第二人民醫(yī)院 燒傷整形科(楊 靜);南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 燒傷整形科(姜會(huì)慶)

楊 靜(1978-)，女，安徽宣城人，主治醫(yī)師，碩士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.019

R-322

A

1673-7040(2014)08-0502-05

2014-03-06)