盧順蘭 何金玲 莫偉堅 唐安洲 譚頌華 劉磊 方勤 謝利紅

1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧 530021)

哺乳動物的聽覺功能依賴于內(nèi)耳毛細胞將聲音振動轉化為電信號，因此毛細胞損傷會導致聽力損失。與鳥類動物毛細胞擁有持續(xù)再生能力相比，成年哺乳動物毛細胞缺乏再生的能力，只有胚胎發(fā)育和新生兒早期存在有限的毛細胞再生能力[1]，因此胚胎小鼠以及新生小鼠被廣泛應用于包括藥物、噪聲等各種原因所致聽力損失的體外研究及毛細胞的再生研究。盡管各種實驗的內(nèi)容和目的不同，體外研究中都不可避免地需要取出耳蝸基底膜進行組織塊培養(yǎng)，以進一步觀察毛細胞或支持細胞的形態(tài)及進行分子生物學研究等[2～6]。既往多數(shù)研究做基底膜培養(yǎng)時多使用E18的胚胎小鼠，但胚胎小鼠耳蝸組織更微小，技術要求更高[7,8]，使用新生小鼠能降低基底膜取材培養(yǎng)技術難度，便于開展基底膜培養(yǎng)的內(nèi)耳相關研究。由于內(nèi)耳結構復雜，取材難度大，了解新生小鼠的內(nèi)耳結構、掌握小鼠內(nèi)耳基底膜取材技術是開展內(nèi)耳研究的最基本的要求。因此，本文通過圖解逐步介紹新生小鼠耳蝸基底膜取材培養(yǎng)技術，為初學者提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取出生3天內(nèi)的新生小鼠3只，雌雄不限，行基底膜的顯微解剖與培養(yǎng)，本實驗通過倫理委員會的批準，動物處死前均進行深度麻醉。

1.2新生小鼠耳蝸基底膜的解剖 為防止基底膜體外培養(yǎng)過程中受到污染，所有解剖器械預先高壓滅菌，將新生小鼠頭部用75%的乙醇消毒, 斷頭,放入預冷的PBS液中,顯微鏡下沿正中從枕骨大孔處剪開顱骨,去除腦組織,取下兩側顳骨后放入裝有預冷的PBS 液的解剖培養(yǎng)皿中,顯微鑷去除耳蝸蝸殼、螺旋韌帶，前庭膜，保留蝸軸及包含 Corti 器的基底膜，從底回到頂回完整地將整個基底膜從蝸軸上分離(圖1、2)。具體步驟如下：①斷頭，正中從枕骨大孔處剪開顱骨頂骨(圖1a、b),去除腦組織,顯微鑷去除已剪開的頂骨骨質，從顱骨面暴露雙側顳骨，此時可見雙側耳蝸蝸尖朝向顱底中線，半規(guī)管朝向外側，且顳骨塊與顱底骨質間有間隙，顯微鑷插入間隙中分離顳骨塊并將其取出，此時顳骨塊形似花生(圖1c、d)。②取下包含耳蝸、前庭及半規(guī)管的內(nèi)耳組織顳骨塊，表面可見膜性組織，鼓室面耳蝸表面有一圓形軟骨環(huán)樣結構，去除膜性組織及軟骨環(huán)樣結構，取下鐙骨，可清晰暴露耳蝸、圓窗和前庭窗，前庭窗深面可見球囊，橢圓囊表面有白色耳石(圖1e)。③用顯微鑷從圓窗或前庭窗插入(圖1f)，沿著耳蝸走行去除耳蝸表面的未鈣化的蝸殼，完全暴露耳蝸外側結構螺旋韌帶(圖1g)，顯微鑷從鉤回或底回插入螺旋韌帶與基底膜之間并分離出部分螺旋韌帶，夾住分離端并撕下螺旋韌帶，此時可見前庭膜及基底膜，撕下前庭膜，保留蝸軸及基底膜，從底回到頂回完整地將整個基底膜從蝸軸上分離(圖1h)。整個分離過程都在預冷的無菌PBS液中進行，時間盡量控制在10分鐘之內(nèi)。

1.3基底膜鋪片及培養(yǎng) 培養(yǎng)皿中放入細胞爬片，細胞貼壁粘附劑(普利萊，C1010，中國)用PBS稀釋至1:200，滴加于細胞爬片表面，使其完全覆蓋細胞爬片，室溫靜置30分鐘后PBS洗去，加入培養(yǎng)液備用。將剝離完整的基底膜用小刮匙移入10%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中(圖3a、b)，分清基底膜中階面及鼓階面后，將中階面朝上，吸出部分培養(yǎng)液(圖3c)，顯微鏡下調(diào)整基底膜位置使其充分展開貼壁，此時完全吸干凈培養(yǎng)液(圖3d)，靜置約1分鐘后，重新緩慢逐滴加入培養(yǎng)液，保證基底膜貼壁不浮起，小心平穩(wěn)的放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?；啄づ囵B(yǎng)體系：13.5 ml DMEM，1.5 ml FBS， 15 μl青鏈霉素混合液(100×)。

1.4基底膜免疫熒光染色 基底膜用4%的多聚甲醛固定30分鐘；PBS 清洗；0.4% Triton X-100 PBS 提高細胞通透性3次，每次5分鐘，加入一抗Goat anti-Sox2 (1∶200, R&D Systems, AF2018，USA),Rabbit anti-Myosin VIIa (1∶300，Abcam,ab150386，UK)后4 ℃冰箱孵育過夜；0.4% Triton X-100 PBS 清洗 3次，每次5分鐘，加入相應熒光二抗Donkey anti-Goat Alexa Fluor 488 (1∶2 000，Thermo Fisher Scientific, A-11055，USA), Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 555 (1∶2 000，Thermo Fisher Scientific, A-31572，USA)避光孵育1小時；PBS 清洗 3 次，取下培養(yǎng)皿細胞爬片，封片后共聚焦顯微鏡下觀察。

圖1 新生小鼠耳蝸基底膜取材解剖 a. 小鼠頭部; b. 剪開顱骨頂骨; c. 去除腦組織,顯示顳骨塊; d. 顳骨塊顱底面; e. 顳骨塊鼓室面; f. 顯微鑷從前庭窗插入; g. 分離蝸殼; h. 基底膜及螺旋韌帶

圖2 新生小鼠基底膜取材示意圖

2 結果

成功分離出完整基底膜，呈自然卷曲狀態(tài)(圖1h)，倒置顯微鏡下觀察基底膜的存活情況，若基底膜貼壁不浮起，其周邊長出增殖細胞，表示基底膜存活，隨著時間的延長，周邊生長的細胞數(shù)量逐漸增多，提示基底膜生長良好(圖4a、b)。若基底膜卷曲、浮起或者基底膜不卷曲，但其周圍未見細胞增殖爬出，培養(yǎng)液比較渾濁，提示基底膜未存活(圖4c、d)。免疫熒光染色顯示出基底膜上的毛細胞與支持細胞的位置及數(shù)量(圖5)。

圖3 基底膜鋪片培養(yǎng) a. 基底膜移入培養(yǎng)皿; b. 調(diào)整基底膜中階面朝上; c.吸出部分培養(yǎng)液,調(diào)整基底膜位置及展開; d. 吸干凈培養(yǎng)液使基底膜貼壁

圖4 倒置顯微鏡下基底膜的形態(tài) a. 基底膜貼壁存活,白線圈出部分提示周邊長出增殖細胞(×4); b. 兩黑線間區(qū)域為毛細胞,外側黑線與白線之間為增殖細胞(×10); c. 基底膜卷曲未成活(×4); d. 基底膜周邊未見細胞增殖爬出,培養(yǎng)液渾濁,基底膜未成活(×10)

圖5 基底膜免疫熒光染色 a. 綠色標記支持細胞,紅色標記毛細胞(×20); b.毛細胞(×20)

3 討論

在內(nèi)耳病理學研究和組織化學研究以及分子生物學研究中，體外培養(yǎng)耳蝸基底膜是常用的研究方法之一[2]。體外培養(yǎng)基底膜是指通過顯微解剖取出基底膜，加以不同的實驗條件培養(yǎng)以達到各種實驗目的的一種研究方法，通常作為開展體外內(nèi)耳研究的第一步。在基底膜離體培養(yǎng)條件下，易于控制實驗條件，減少體內(nèi)其它混雜因素的干擾，有助于研究單一實驗條件對基底膜及Corti器的作用，可結合免疫熒光染色分析基底膜上毛細胞與支持細胞的增殖、損傷等變化，為深入研究內(nèi)耳毛細胞再生、藥物損傷或保護內(nèi)耳等機制打下基礎。由于內(nèi)耳解剖結構復雜精巧且膜迷路柔軟輕薄，解剖過程中容易被器械損傷，取材難度較大，短時間內(nèi)難以掌握，阻礙了初學者上述內(nèi)耳研究實驗的開展。本文介紹了新生小鼠的內(nèi)耳基底膜取材方法，無論是新生小鼠還是成年小鼠的取材，都需要對小鼠內(nèi)耳解剖結構了如指掌，更離不開在解剖顯微鏡下的實際操作練習。盡管有學者已經(jīng)發(fā)表小鼠、大鼠等內(nèi)耳解剖以及基底膜離體培養(yǎng)相關的文章[9-12]可供參考學習，但是多以文字為主，本文進一步補充了耳蝸基底膜解剖分離以及培養(yǎng)每一步驟的示意圖及顯微解剖圖片，通過圖解直觀地展示了耳蝸基底膜解剖分離技術顯微鏡下操作的細節(jié)，相較于文字描述，更加簡單易懂，有助于初學者一步一對照地練習基底膜取材技術。此外，以往研究常用的基底膜培養(yǎng)方法中多用膠原凝膠促進基底膜貼壁[7,10]，膠原凝膠由三種溶液配制，分別是0.02N醋酸加上50X的I型鼠尾膠原蛋白(溶液A)和10X Basal Medium Eagle(溶液B)以及2%碳酸鈉(溶液C)，將A、B、C三種溶液按9∶1∶1的比例充分混合，滴于培養(yǎng)皿中，室溫下放置30分鐘凝結為固態(tài)的膠凍。本研究采用細胞貼壁粘附劑預先處理細胞爬片，不需要額外配制膠原凝膠，操作簡單，基底膜附著細胞爬片貼壁效果良好，利用細胞貼壁粘附劑可以簡化耳蝸基底膜離體培養(yǎng)步驟，提高基底膜貼壁成功率，有效縮短了實驗操作時間，是一種可推廣的改良基底膜培養(yǎng)方法。本文從取材培養(yǎng)到熒光染色，將整個過程具象化，希望能為需要學習取材培養(yǎng)技術的初學者提供更多相關細節(jié)，以盡快掌握基底膜取材培養(yǎng)技術，開展內(nèi)耳研究。