丁 爽， 李青峰， 李廣帥， 鄭 巖， 于冬梅， 羅 賽， 郝立君

實驗研究

神經(jīng)再生條件液對成纖維細胞和施旺細胞的生物學活性影響

丁 爽， 李青峰， 李廣帥， 鄭 巖， 于冬梅， 羅 賽， 郝立君

目的探索神經(jīng)再生條件液對體外培養(yǎng)的大鼠成纖維細胞和施旺細胞的生物學活性影響。方法用含有不同濃度的NRCF的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)成纖維細胞和施旺細胞24 h,用CCK-8法檢測細胞增殖;用流式細胞儀檢測細胞周期,免疫熒光法檢測施旺細胞去分化。結(jié)果隨著神經(jīng)再生條件液濃度的提高及神經(jīng)再生條件液對細胞作用時間的增加，成纖維細胞和施旺細胞的增殖呈上升趨勢; 神經(jīng)再生條件液對成纖維細胞和施旺細胞的細胞周期改變發(fā)生在S期；神經(jīng)再生條件液能夠促進施旺細胞去分化。結(jié)論神經(jīng)再生條件液能夠促進成纖維細胞的增殖并促進施旺細胞的增殖和去分化。

外周神經(jīng)損傷； 神經(jīng)再生條件液； 成纖維細胞； 施旺細胞； 細胞增殖； 去分化

周圍神經(jīng)損傷時，在損傷的神經(jīng)遠、近兩斷端間橋接一個硅膠管，形成一個密閉間隔，這個密閉的間隔被稱之為神經(jīng)再生室。神經(jīng)再生室模型所提供的封閉環(huán)境是研究周圍神經(jīng)再生的重要模型。神經(jīng)再生室內(nèi)所形成的再生微環(huán)境及其中的主要成分被稱為神經(jīng)再生條件液(nerve regeneration conditioned fluid, NRCF )[1]。研究顯示，NRCF非常適合對源于創(chuàng)傷神經(jīng)干斷端的活性因子的研究[1]。成纖維細胞和施旺細胞被證實大量存在于周圍神經(jīng)當中[2]，自2012年3月，我們的實驗著重研究NRCF對這兩種細胞的生物學活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Lewis雄性大鼠(華東師范大學SPF動物中心提供)；新生Lewis大鼠1～3 d(上海交通大學附屬第九人民醫(yī)院SPF動物房提供)；DMEM培養(yǎng)基(美國THERMO公司)；PBS、膠原酶(Collagenase NB4，德國SERVA公司);中性蛋白酶(dispaseⅡ，美國SIGMA公司); Anti-p75 NGF Receptor antibody(英國ABCAM公司)。

1.2 神經(jīng)再生室模型的建立及NRCF的提取 采用雄性Lewis大鼠50只，體質(zhì)量約150 g。將大鼠麻醉后，顯露坐骨神經(jīng),于坐骨切跡下10.0 mm處剪斷神經(jīng)并去除2.0 mm，用消毒后內(nèi)徑1.5 mm、長14.0 mm硅膠管橋接兩斷端，形成神經(jīng)再生室模型。術(shù)后按標準飼養(yǎng)動物，1周后，用微量注射器抽取再生室中的NRCF，每側(cè)神經(jīng)再生室獲取NRCF 3～5 μl，共獲取NRCF約200 μl。-80 ℃低溫凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞培養(yǎng) 原代成纖維細胞和施旺細胞的提取及培養(yǎng)原代成纖維細胞和施旺細胞的提取。新生1～3 d的Lewis大鼠20只,取出坐骨神經(jīng),加入0.2%Collagenase NB4與0.2%dispase 1∶1混合液待充分消化后,放置5%CO2、37 ℃ 飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，用酶純化法純化施旺細胞。將純化后剩余的成纖維細胞和純化后的施旺細胞分別接種培養(yǎng)瓶中，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

1.4 組織塊細胞培養(yǎng)法 采用雄性Lewis大鼠20只，體質(zhì)量120 g左右。將大鼠麻醉后，截取出坐骨神經(jīng)。在顯微鏡下修剪成長2.0～3.0 mm的小段，分別用DMEM培養(yǎng)基(對照組，A組)及含有NRCF濃度為1×104ng/ml的DMEM培養(yǎng)基(實驗組，B組)在5%CO2、37 ℃飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。到達時間點后，提取培養(yǎng)的神經(jīng)置入含4%多聚甲醛的溶液中，4 ℃固定，備用。

1.5 CCK-8法 ①NRCF對成纖維細胞和施旺細胞的濃度梯度檢測。細胞倍增時間取培養(yǎng)的細胞進行消化、離心、重懸、計數(shù)。按每孔1500 個細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，分7組：1組作為對照組(DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)設為組1)；其余6組作為實驗組(含有不同NRCF濃度的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng))分別設定NRCF濃度為：10、100、1×103、1×104、1×105、1×106ng/ml(依次設定為組2～7)，每組設6個復孔。置于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種后培養(yǎng)24 h用酶標儀檢測吸光值。②NRCF對成纖維細胞和施旺細胞的時間梯度檢測。細胞倍增時間取培養(yǎng)的細胞進行消化、離心、重懸、計數(shù)。按每孔1500個細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，分兩組：1組作為實驗組(含有NRCF濃度為1×104ng/ml的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，設為組1)；2組作為對照組(DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，設為組2)，每組設6個復孔。置于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別以培養(yǎng)6、12、18、24 設為時間點。到達時間點后，用酶標儀檢測吸光值。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期 細胞倍增時間取培養(yǎng)的細胞進行消化、離心、重懸、計數(shù)，接種于培養(yǎng)板中，分兩組：1組作為實驗組(含有NRCF濃度為1×104ng/ml的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，設為組A)；2組為對照組(DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別設為組B、C、D、E)，每組設3個復孔。接種后分別培養(yǎng)6、12、18、24 h，收集細胞，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 免疫熒光 在顯微鏡下，將固定好的體外培養(yǎng)的神經(jīng)平鋪于載玻片上，標本固定后，進行免疫熒光染色。封片劑封片后,熒光顯微鏡下進行觀察。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行處理，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，方差不齊時則采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測增殖作用 ①成纖維細胞的增殖。通過CCK-8法檢測到成纖維細胞在含有不同濃度的NRCF培養(yǎng)基作用24 h后, 成纖維細胞的增殖隨著NRCF濃度的增加成上升趨勢,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。當NRCF濃度設定為1×104ng/ml時，24 h內(nèi)隨著NRCF作用時間的延長,成纖維細胞的增殖呈遞增趨勢(圖1)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。②施旺細胞的增殖。通過CCK-8法檢測到施旺細胞在含有不同濃度的NRCF的培養(yǎng)基作用24 h后,當其濃度達1×104ng/ml以上時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；當其濃度為1×104ng/ml時，24 h內(nèi)隨著NRCF作用時間的延長,施旺細胞的增殖呈遞增趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。2.2 流式細胞儀檢測細胞周期 ①成纖維細胞的細胞周期變化。用含有1×104ng/ml濃度的NRCF培養(yǎng)基培養(yǎng)成纖維細胞,持續(xù)觀察24 h。通過流式細胞儀檢測的數(shù)據(jù)分析，成纖維細胞的細胞周期變化主要表現(xiàn)在S期(P<0.05)，S期的變化隨著培養(yǎng)時間的增加成上升趨勢，18 h到達高峰(圖3)；②施旺細胞的細胞周期變化。用含有1×104ng/ml濃度的NRCF培養(yǎng)基培養(yǎng)施旺細胞,持續(xù)觀察24 h時。通過流式細胞儀檢測的數(shù)據(jù)分析，施旺細胞的細胞周期變化主要表現(xiàn)在S期(P<0.05)。S期的變化隨著培養(yǎng)時間的增加呈上升趨勢(圖4)。

2.3 免疫熒光法驗證去分化 用含有1×104ng/ml濃度的NRCF培養(yǎng)基體外培養(yǎng)大鼠坐骨神經(jīng)，連續(xù)培養(yǎng)3 d，用施旺細胞特征性去分化抗體P75進行免疫熒光染色(紅色)?？梢杂^察到實驗組與對照組有差異(圖5)，說明NRCF能夠促進施旺細胞去分化。

圖1 成纖維細胞的時間增殖曲線圖2 施旺細胞的時間增殖曲線(組1:實驗組NRCF濃度為1×104ng/ml的DMEM培養(yǎng)基；組2:對照組DMEM培養(yǎng)基)

Fig1 Time-dependency proliferation curve of fibroblasts.Fig2 Time-dependency proliferation curve of Schwan cells(Group 1: the experimental group with DMEM including 1×104ng/ml NRCF. Group 2: the control group with DMEM).

3 討論

神經(jīng)再生具有自我完善和自我調(diào)控的能力(MA Bisby，1983年)。周圍神經(jīng)損傷后，能否實現(xiàn)成功再生，與神經(jīng)趨化性，損傷的局部對軸突的接觸引導作用，以及再生微環(huán)境等因素密切相關。近年來，隨著人們對分子生物學的深入研究，發(fā)現(xiàn)再生微環(huán)境是外周神經(jīng)損傷后能否實現(xiàn)成功再生的關鍵因素(朱家愷，1991年)。NRCF作為神經(jīng)再生室中的功能性成分,體現(xiàn)了周圍神經(jīng)再生微環(huán)境的特征[3]。NRCF能夠?qū)υ偕窠?jīng)提供營養(yǎng)、支持和導向的作用，是神經(jīng)再生自我完善及自我調(diào)控機制充分發(fā)揮的重要條件[1]。較早的研究中，推測NRCF中可能主要存在三類物質(zhì)：神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors, NTFs)、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM )和促突起生長因子(neuritepromoting factors, NPFs)[4]。李青峰等[5]通過Native PAGE分離NRCF中的蛋白成分進行分析，發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量為(232～440)×103的蛋白能促使后根神經(jīng)節(jié)突起的生長，說明NRCF具有明顯的神經(jīng)營養(yǎng)性和再生趨化性。

通過BCA法檢測，我們粗略地計算出提取出來的NRCF的蛋白濃度約為50 mg/ml。在本實驗中可以觀察到，當NRCF的濃度為1×103ng/ml時，就可以明顯地促進成纖維細胞的增殖作用，說明NRCF中的蛋白成分對成纖維細胞具有重要的作用。本實驗中觀察到，隨著NRCF濃度的提高，成纖維細胞的增殖呈上升趨勢；隨著NRCF對成纖維細胞作用時間的增加，增殖也呈上升趨勢。在CCK-8法和流式細胞儀檢測結(jié)果中均發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞的增殖高峰，發(fā)生在NRCF對其作用18 h后，說明18 h是NRCF對成纖維細胞作用的關鍵時間點。Sorrell 和Caplan[6]驗證了外周神經(jīng)損傷早期，大量的成纖維會聚集在損傷部位并發(fā)揮作用。本實驗通過NRCF對成纖維細胞的促增殖作用，驗證了大量成纖維細胞出現(xiàn)的原因。說明NRCF能夠通過促進成纖維細胞的增殖作用促進外周神經(jīng)的修復。

沃勒變性(wallerian degeneration, WD )是外周神經(jīng)系統(tǒng)最初級的反應。它發(fā)生當外傷性、中毒性、缺血性或代謝性事件發(fā)生時所引起的神經(jīng)纖維連續(xù)性的中斷[7]。WD包括軸索變性并伴隨脫髓鞘的發(fā)生。脫髓鞘的早期是由施旺細胞的去分化所引起，所以軸突的離斷，導致了施旺細胞之間缺少了聯(lián)系，與施旺細胞去分化的開始有關[8]。本實驗中發(fā)現(xiàn)，當NRCF的濃度為1×104ng/ml時，可以促進施旺細胞的增殖，同時也可以促進施旺細胞去分化。軸突受損傷以后，施旺細胞會發(fā)生一系列變化，包括通過增殖和去分化來促進軸突的再生[9-10]。本實驗中也驗證了這一點， NRCF能夠促進施旺細胞的增殖和去分化，說明NRCF能通過促進施旺細胞的增殖和去分化來促進軸突的再生。

軸突的損傷可引起一系列的事件，例如，血-神經(jīng)屏障破壞、施旺細胞的增殖、巨噬細胞的聚集[11-12]、神經(jīng)內(nèi)膜的空間重組、細胞外基質(zhì)成分的改變以及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的提高和細胞因子的產(chǎn)生。NRCF是損傷局部發(fā)生的早期微環(huán)境，是神經(jīng)再生自我完善及自我調(diào)控機制充分發(fā)揮的重要條件[1]。本實驗選取NRCF濃度為1×104ng/ml時,已經(jīng)有效地證明了NRCF能夠促進成纖維細胞和施旺細胞的增殖作用,以及促進施旺細胞去分化的作用,進而促進外周神經(jīng)的修復和再生,體現(xiàn)其生物學特性。NRCF當中存在大量的蛋白成分，但是對NRCF的提取、分離及對其中蛋白成分的檢測，也十分困難。因為模型中NRCF獲取的量有限，接下來我們還需要選取更多濃度進行檢驗，以明確NRCF對成纖維細胞和施旺細胞的最佳作用濃度和時間。另外，NRCF對成纖維細胞和施旺細胞的作用是通過其中的哪一種或者哪一些蛋白起到的作用，還需要我們進一步地檢驗，同時這種或這些蛋白通過什么途徑發(fā)揮的作用也需要我們做深入地研究，從而使NRCF在外周神經(jīng)損傷修復的臨床工作中發(fā)揮最大的生物學作用。

圖3 NRCF對成纖維細胞的細胞周期中S期的影響圖4 NRCF對施旺細胞的細胞周期中S期的影響圖5 NRCF對施旺細胞的去分化作用 a. 對照組DMEM培養(yǎng)基 b. 實驗組NRCF濃度為1×104ng/ml的培養(yǎng)基

Fig3 Effect of NRCF on Phase S of the cell cycle of fibroblasts.Fig4 Effect of NRCF on Phase S of the cell cycle of Schwann cells.Fig5 Effect of NRCF on dedifferentiation of Schwann cells. a. the control group with DMEM. b. the experimental group with DMEM including 1×104ng/ml NRCF.

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EffectofnerveregenerationconditionedfluidonbiologicactivityoffibroblastsandSchwanncells

DINGShuang,LIQing-feng,LIGuang-shuai,etal.
(PlasticandCosmeticCenter,TheFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

ObjectiveTo explore the effect of nerve regeneration conditioned fluid on biologic activity of rat fibroblasts and schwann cells in vitro.MethodsThe rat fibroblasts and Schwann cells were cultured continuously in NRCF at the different concentrations for 24 hours. The cell proliferation, cell cycle and dedifferentiation of the Schwann cells were detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8), flow cytometry (FCM) and immunofluorescence, respectively.ResultsThe proliferation intensity of cultured cells increased with the increasing concentration of NRCF. The proliferation intensity of the fibroblasts and Schwann cells cultured with the same concentration of NRCF for 24 hours increased with the increasing hours. The changes of the cell cycle of fibroblasts and Schwann cells caused by NRCF occurred mainly at Phase S. NRCF had positive effect on promoting the dedifferentiation of Schwann cells.ConclusionNRCF can promote the proliferation of fibroblasts. NRCF can promote the proliferation and dedifferentiation of Schwann cells.

Peripheral nerve injury； Nerve regeneration conditioned fluids； Fibroblast ； Schwann cell； Proliferation； Dedifferentiation

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.04.019

R332

A

1673-7040(2014)04-0245-04

2014-01-09)

150001 黑龍江 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 整形美容中心(丁 爽，于冬梅，羅 賽，郝立君);上海交通大學附屬第九人民醫(yī)院 整復外科(李青峰，鄭 巖)；鄭州大學第一附屬醫(yī)院 整形外科(李廣帥)

丁 爽(1985)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生.

郝立君，150001，哈爾濱醫(yī)科大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 整形美容中心，電子信箱：lijun337@yahoo.com.cn