黃佳誠(chéng), 柳大烈, 黃子龍, 南 華

實(shí)驗(yàn)研究

氯化鈷預(yù)處理對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞成脂及增殖的影響

黃佳誠(chéng), 柳大烈, 黃子龍, 南 華

目的觀察脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)在經(jīng)氯化鈷(CoCl2)預(yù)處理的條件下，其增殖、細(xì)胞狀態(tài)變化以及成脂肪化傾向。方法通過有限稀釋法分離、培養(yǎng)SD大鼠ADSCs，取第3代ADSCs，分別向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化鑒定，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠ADSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29，CD34，CD44，CD45的表達(dá)。將ADSCs經(jīng)不同濃度CoCl2干預(yù),利用Western blot檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達(dá)情況。同時(shí)，利用MTT實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)大鼠ADSCs在不同濃度的CoCl2下細(xì)胞增殖的改變；并且通過油紅O定量檢測(cè)大鼠ADSCs在經(jīng)歷缺氧后的成脂情況。結(jié)果第3代ADSCs在倒置顯微鏡下觀察，大多呈梭形,經(jīng)流式鑒定，大鼠ADSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44表達(dá)率高，而CD34、CD45表達(dá)率低，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠ADSCs能夠向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化，具有較高的自我更新能力。在MTT實(shí)驗(yàn)中，400、200 μmol/L CoCl2組，ADSCs增值減弱；而100、50 μmol/L CoCl2的實(shí)驗(yàn)組，缺氧造成的對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性與空白對(duì)照組相比，沒有變化(P>0.05)。HIF-1α的表達(dá)隨著培養(yǎng)基中的CoCl2的濃度而增加。在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨著CoCl2濃度的升高以及時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠ADSCs的成脂傾向越發(fā)明顯(P<0.001)。結(jié)論ADSCs在處于體外適量的CoCl2干預(yù)情況時(shí)，其增殖并不會(huì)受到影響，并且呈顯著的增強(qiáng)其成脂傾向。

脂肪來源干細(xì)胞； 氯化鈷； 成脂分化

自體脂肪組織抽吸注射移植術(shù)是常見的整形手術(shù)，有關(guān)提高脂肪成活率的研究一直是脂肪移植術(shù)中的重點(diǎn)。有學(xué)者提出脂肪移植術(shù)后脂肪吸收率較高的原因可能是由于脂肪組織移植后，脂肪細(xì)胞處于一個(gè)相對(duì)局部缺氧的環(huán)境從而導(dǎo)致其壞死、液化[1]。一些研究表明，在移植的脂肪組織中加入事先培養(yǎng)好的脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)可以達(dá)到更好的臨床效果[1-2]。氯化鈷(CoCl2)是一種成熟的缺氧模型制造劑，已被廣泛用于制作體外和體內(nèi)細(xì)胞缺氧的環(huán)境[3-6]。自2013年2-8月，我們通過ADSCs經(jīng)由一個(gè)梯度的CoCl2的濃度體外培養(yǎng)，檢測(cè)ADSCs在該環(huán)境下培養(yǎng)時(shí)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α)的表達(dá)，并通過MTT實(shí)驗(yàn)及油紅O染色定量檢測(cè)，觀察隨著缺氧程度及缺氧時(shí)間的改變，脂肪干細(xì)胞增殖能力及成脂趨勢(shì)的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

SD成年大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、β-甘油磷酸鈉、維生素C、1- 甲基-3- 異丙基黃嘌呤、吲哚美辛、DMEM-F12、胎牛血清(FBS)、細(xì)胞表面抗原檢測(cè)用試劑鼠抗人CD29-PE、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC(美國(guó)BIOLEGEND公司)；兔抗鼠單克隆抗體HIF-1α(美國(guó)SANTA CRUX公司)；CoCl2(美國(guó)SIGMA公司)；Olympus倒置顯微鏡, HERUS CO2培養(yǎng)孵箱, 超凈工作臺(tái),低溫離心機(jī), BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠ADSCs的獲取 無菌條件取大鼠腹股溝脂肪墊, 用PBS沖洗,超凈臺(tái)內(nèi)切碎后用加入0.1%Ⅰ型膠原酶吸管反復(fù)吹打,37 ℃孵育45 min, 加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化, 離心, 重懸細(xì)胞, 150目篩網(wǎng)過濾；再次離心后，重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶中, 置37 ℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)。24 h后即可見到有少量細(xì)胞貼壁；48 h后換液, 5～7 d 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后胰酶消化，擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 ADSCs的流式細(xì)胞儀鑒定 取培養(yǎng)至3代的細(xì)胞，PBS洗1遍，計(jì)數(shù)，1×106/管分裝5管，抗體用0.1%BSA稀釋，100 μl/管，抗體室溫避光孵育1 h。流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSCs表面抗原的表達(dá)。

1.2.3 ADSCs多向分化能力的檢測(cè) 選取第3 代ADSCs 接種到6孔板, 每皿5×104/ml細(xì)胞, 在37℃、5%CO2條培養(yǎng)24 h后，分別加入成骨誘導(dǎo)劑(0.1 μmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉)或成脂誘導(dǎo)劑(0.25 μmol/L地塞米松、50 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰島素)，對(duì)照組為單純含10%FBS的培養(yǎng)基。每3 d換液，分別于7 d和28 d后，用茜素紅鈣鹽染色法及油紅O染色法來測(cè)定ADSCs的多向分化能力。

1.2.4 MTT檢測(cè)不同濃度的CoCl2對(duì)細(xì)胞增殖的影響 選取第3代ADSCs接種到96孔板，每孔2000個(gè)細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2條培養(yǎng)24 h后，分別加入CoCl2使得每個(gè)孔中CoCl2的濃度分別為0、50、100、200、400 μmol/L，并設(shè)置校零孔。然后分別在加藥6、24、48、72 h后加入20 μl的MTT試劑，然后通過酶標(biāo)儀測(cè)得其在490 nm下的OD值。

1.2.5 Western blot檢測(cè)不同組中HIF-1α蛋白表達(dá)

提取各組中的ADSCs蛋白，定量后添加SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸7 min，每組上樣20 μg，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂奶4 ℃封閉2 h，兔抗鼠HIF-1α(1∶1000) 4 ℃過夜，羊抗兔近紅外二抗4 ℃避光封閉2 h，Odyssey近紅外成像系統(tǒng)中掃描、分析。

1.2.6 選取第3 代ADSCs 接種到6孔板, 每皿5×104/ml細(xì)胞, 在37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)24 h后，加入CoCl2使其濃度分別為100、50、0 μmol/L。3 d換液1次，保留其藥物濃度，每天在顯微鏡下觀察，并于7、14 d后用油紅O染色后，加入異丙醇溶液500 μl/孔，震蕩脫色10 min，使細(xì)胞內(nèi)染色甘油三酯充分溶解，酶標(biāo)儀540 nm處測(cè)光吸收值[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠ADSCs的原代培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

原代ADSCs培養(yǎng)48 h換液后，即可觀察到貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)短小，呈長(zhǎng)梭形(圖1a)。培養(yǎng)至4 d，細(xì)胞明顯增多、變大，長(zhǎng)梭形、紡錘形形態(tài)更加明顯(圖1b)。在傳代培養(yǎng)中，細(xì)胞基本保持長(zhǎng)梭形的形態(tài)(圖1c)。

2.2 ADSCs分化能力鑒定

成骨誘導(dǎo)7 d后，油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)有鮮紅色透亮脂滴形成(圖2a)。成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色均陽性，表明誘導(dǎo)后脂肪干細(xì)胞外基質(zhì)中有鈣結(jié)節(jié)形成(圖2b)。

2.3 大鼠ADSCs的流式細(xì)胞儀鑒定

流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ADSCs陽性表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD44，陽性率均為90%以上，低表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD45(圖2c)，表明取得的ADSCs純度較高。

2.4 不同濃度的CoCl2對(duì)ADSCs增殖的影響

MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加入200、400 μmol/L的CoCl2相比空白對(duì)照組，ADSCs的增殖能力受很大抑制(P<0.05)；而100 μmol/L和50 μmol/L組ADSCs的增殖能力并未產(chǎn)生明顯影響(P>0.05，圖3)。

2.5 不同濃度的CoCl2對(duì)ADSCs的HIF-1α表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，HIF-1α蛋白在50 μmol/L和100 μmol/L組中的細(xì)胞均有表達(dá)，且均高于對(duì)照組的表達(dá)量(圖4)。

2.6 不同濃度的CoCl2培養(yǎng)液對(duì)ADSCs成脂的影響

觀察各組細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，CoCl2組呈較多脂滴(圖5)。在對(duì)照組中，通過油紅O染色后定量測(cè)量發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，加入CoCl2組中的ADSCs的成脂肪趨勢(shì)更加明顯(P<0.001，表1)。

圖1 ADSCs的形態(tài) a. 原代ADSC培養(yǎng)2 d后(×200) b. P1代ADSCs 培養(yǎng)4 d后(×100) c. P3代ADSCs培養(yǎng)4 d后(×100)圖2 脂肪干細(xì)胞的分化能力 a. ADSCs成脂誘導(dǎo)7 d后油紅O染色 (×400) b. ADSCs成骨誘導(dǎo)28 d后茜素紅染色(×200)圖3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)處于不同濃度的CoCl2后，不同時(shí)間ADSCs增殖能力的變化圖4 Western blotting檢測(cè)各組標(biāo)本中HIF-1α的表達(dá)圖5 培養(yǎng)14 d后，觀察光鏡下各組油紅O染色結(jié)果 a.對(duì)照組(×200) b.50 μmol/L組(×200)c.100 μmol/L組(×200)

Fig1 ADSCs under the inverted microscope. a. original ADSCs at 2 days after culture (×200). b. P1 ADSCs at 4 days after culture (×100). c. P3 ADSCs at 4 days after culture (×100).Fig2 ADSCs differentiation a. ADSCs of adipogenic differentiation at 7 days by Oil red staining (×400). b. ADSCs of osteogenic differentiation at 7 days by Alizarin red staining (×200) .Fig3 The proliferation activity levels of ADSCs at different CoCl2concentration in each group.Fig4 The protein levels of HIF-1α in each groups.Fig5 ADSCs at 14 days after culture by Oil red staining in each groups. a. control group(×200). b. 50 μmol/L group(×200).c. 100 μmol/L group(×200).

表1 不同濃度的CoCl2對(duì)ADSCs的成脂分化的影響Tab1 Effect of CoCl2 at different concentrations on ADSCs adipogenic differentiation n=5

注：*主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值；#交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

3 討論

脂肪干細(xì)胞因具有易獲得性及不涉及倫理問題等優(yōu)點(diǎn)而成為理想的種子細(xì)胞來源[8-9]。在臨床中已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將脂肪干細(xì)胞混入需要移植的脂肪細(xì)胞后，能較單一的脂肪細(xì)胞注射達(dá)到更好療效[10]。從而提示我們需要探求脂肪干細(xì)胞在這樣一個(gè)相對(duì)缺氧環(huán)境中，它的增殖是否受到影響以及在這種情況下轉(zhuǎn)歸如何。

目前，國(guó)內(nèi)外一些研究表明，將用于治療的間充質(zhì)干細(xì)胞事先經(jīng)過一定程度的預(yù)缺氧，可以得到更好的治療效果，并提出這可能是由于細(xì)胞內(nèi)的HIF-1的調(diào)節(jié)[11-13]。HIF-1分為HIF-1α和HIF-1β的形式存在，其中HIF-1α屬于功能性亞基，HIF-1β屬于結(jié)構(gòu)性亞基，HIF-1α亞基的表達(dá)活性決定了HIF-1的生理活性，因此，HIF-1α在調(diào)控組織中氧代謝的適應(yīng)反應(yīng)中起重要作用。目前，已經(jīng)明確的受缺氧誘導(dǎo)因子1調(diào)控的靶基因有100多個(gè)[2,14]。研究表明，這些靶基因影響著干細(xì)胞的增殖、分化、遷移等[15-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs在50 μmol/L和100 μmol/L的CoCl2的缺氧環(huán)境下，HIF-1α蛋白的表達(dá)均高于不缺氧組，即在該濃度的缺氧環(huán)境下，可以誘導(dǎo)HIF-1α蛋白的表達(dá)。

CoCl2是一種成熟的缺氧模型介導(dǎo)試劑，已被廣泛應(yīng)用在體外和體內(nèi)激活HiF-α[3-6]。所以，有必要探求脂肪干細(xì)胞在增殖及轉(zhuǎn)歸過程中是否受到CoCl2濃度的影響，于是我們通過讓ADSCs處于含有梯度CoCl2濃度的培養(yǎng)環(huán)境，采用MTT檢測(cè)他們的增殖率。我們可以發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞只有在處于200、400 μmol/L這樣的培養(yǎng)環(huán)境，才會(huì)出現(xiàn)增值減弱和死亡的現(xiàn)象。低濃度CoCl2的培養(yǎng)環(huán)境并不會(huì)對(duì)ADSCs的增值產(chǎn)生影響。而且，通過Western blotting我們證明了CoCl2能使HIF-1α的表達(dá)隨著其濃度的升高而上升。ADSCs具有穩(wěn)定擴(kuò)增的特性，在正常體外環(huán)境培養(yǎng)時(shí)，并不會(huì)表現(xiàn)出特定的分化傾向。我們的研究表明，ADSCs在CoCl2環(huán)境下培養(yǎng)時(shí)，隨著濃度的提高，脂肪干細(xì)胞的成脂傾向越發(fā)明顯。我們使用了經(jīng)過MTT試驗(yàn)得出的對(duì)ADSCs增殖沒有影響的0、50、100 μmol/L這3個(gè)組，在沒有加入成脂誘導(dǎo)劑量的情況下，在50 μmol/L組中我們可以觀察到脂肪干細(xì)胞發(fā)生了明顯的自體成脂傾向，而對(duì)照組中則沒有改變，同時(shí)隨著CoCl2的濃度的上升，100 μmol/L脂肪干細(xì)胞的成脂趨勢(shì)會(huì)顯得更快更加明顯。這提示我們?cè)谶M(jìn)行含有脂肪干細(xì)胞的脂肪移植術(shù)中，移植的脂肪干細(xì)胞由于處于一定的缺氧環(huán)境，脂肪干細(xì)胞可能會(huì)具有一種成脂分化的趨勢(shì)，并且它的增殖并沒有受到影響。這也可能是由于缺氧誘導(dǎo)因子HiF-α調(diào)控靶基的結(jié)果,從而使脂肪干細(xì)胞能夠快速增殖并分化為成熟的脂肪細(xì)胞，并使術(shù)后效果較單一的脂肪移植術(shù)好。因此，在進(jìn)行含有脂肪干細(xì)胞的脂肪移植術(shù)時(shí)，事先將脂肪干細(xì)胞進(jìn)行一定的預(yù)缺氧處理可能會(huì)取得更好的臨床療效。

本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)比較了不同濃度的CoCl2對(duì)ADCSs增殖及分化的影響，由此顯示，適當(dāng)?shù)腃oCl2培養(yǎng)環(huán)境會(huì)刺激脂肪干細(xì)胞的成脂分化能力并且不影響其增殖。但是，究竟通過哪些信號(hào)通路并且通過什么樣的方式調(diào)整還有待于進(jìn)一步地研究。

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Effectofcobaltchloridepreprocessingontheproliferationandadipogenicdifferentiationofratadipose-derivedstemcells

HUANGJia-cheng,LIUDa-lie,HUANGZi-long,etal.
(DepartmentofPlasticandCosmeticSurgery,ZhuJiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China)

ObjectiveTo observe the effect of cobalt chloride(Cocl2) preprocessing on the proliferation and adipogenic differentiation of rat adipose-derived stem cells(ADSCs).MethodsRat ADSCs were isolated from adipose tissue obtained from rat and were cultured, ADSCs at Passage 3 were cultured in adipogenic, osteogenetic differentiation medium and underwent identification, flow cytometric analysis for cell surface antigen CD29, CD34, CD44 and CD45 were performed. To confirm the effect of cobalt chloride preprocessing on adipogenic differentiation of ADSCs, CoCl2, a HIF stabilizer was used to mimic the hypoxic condition. The expression of HIF-1α were observed by Western blotting. Growth condition of the cells was observed by inverted microscope. MTT method was used to observe cell proliferation activity at different concentrations after hypoxic culture. The effects of hypoxic condition to ADSCs adipogenic differentiation was detected by Oil Red O quantitative assay.ResultsMost ADSCs at Passage 3 were spindle-shaped under the inverted microscope. Flow cytometric analysis showed CD29 and CD44 were positive; CD 34 and CD45 were negative. ADSCs were induced in vitro to osteoblasts and lipoblasts. MTT method revealed the Optical Density value of 100 and 50 μmol/L-1CoCl2and control group were no significant differences between each groups (P>0.05). HIF-1 alpha protein was increased with the CoCl2concentration increasing. At 7th and 14th days after hypoxia culture, Oil Red O quantitative assay showed hypoxia had a significant impact on ADSCs adipogenic capacity (P<0.001).ConclusionCobalt chloride preprocessing condition will enhance the adipogenic differentiation ability of ADSCs and proliferation activity will not be affected.

ADSCs; Cobalt chloride; Adipogenic differentiation

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.04.016

R332

A

1673-7040(2014)04-0235-05

2013-11-18)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171831)

510282 廣東 廣州,南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 整形美容外科

黃佳誠(chéng)(1987-),男,江蘇泰州人,碩士研究生.

柳大烈，510282，南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 整形美容外科，電子信箱：liudalie@hotmail.com