孫 強， 郭 澍， 唐明睿， 王玉新， 王 迪

實驗研究

外源性CSMD1對黑色素瘤A375細胞活性的影響

孫 強， 郭 澍， 唐明睿， 王玉新， 王 迪

目的研究經(jīng)pCDNA-3.0-CSMD1轉(zhuǎn)染的A375細胞的活性，探討外源性CSMD1的表達對黑色素瘤細胞活性的影響。方法培養(yǎng)人黑色素瘤A375細胞株，利用前期實驗獲得的CSMD1基因，構(gòu)建質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染細胞。A375細胞分為：A組，未轉(zhuǎn)染的A375細胞；B組，經(jīng)pCDNA-3.0轉(zhuǎn)染的A375細胞；C組，經(jīng)pCDNA-3.0-CSMD1轉(zhuǎn)染的A375細胞。應(yīng)用MTT法、細胞周期分析法、細胞凋亡相關(guān)檢測(DAPI染色、Annexin V-FITC/PI雙染、Transwell細胞遷移實驗)等方法，檢測A375細胞的活性，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果C組細胞的增殖率明顯低于其他兩組細胞(P<0.05)；C組細胞G1期的比例高于其他兩組細胞(P<0.05)；僅在C組細胞中發(fā)現(xiàn)凋亡細胞核固縮，并在48 h內(nèi)出現(xiàn)核碎裂；C組細胞凋亡率為32.7%，明顯高于A組(6.6%)和B組(8.4%)細胞(P<0.05)；與A組和B組細胞相比，C組細胞極少遷移至聚碳酸酯膜下層(P<0.05)。結(jié)論外源性CSMD1可以抑制黑色素瘤A375細胞的活性，這有可能為黑色素瘤的治療提供一種新的途徑。

CSMD1； 黑色素瘤； A375細胞

CSMD1(Cub and Sushi multiple domain 1 gene)被認為是許多癌組織和細胞的抑制基因[1-2]。有學(xué)者報道，前列腺癌、膀胱癌和頭頸部癌癥患者不良的生存率與CSMD1的缺失有關(guān)[3]。然而，CSMD1在黑色素瘤中的作用還未被檢驗過。前期實驗中,我們已首次證實，與正常皮膚細胞相比，黑色素瘤細胞中的CSMD1 mRNA和蛋白的表達水平明顯降低[4]。本實驗將研究經(jīng)pCDNA-3.0-CSMD1轉(zhuǎn)染的A375細胞的活性，探討外源性CSMD1的表達對黑色素瘤細胞活性的影響，揭示CSMD1在黑色素瘤中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；流式細胞儀、CellQuest軟件(美國BD公司)；微孔盤讀取儀(美國BIO-RAD公司)；博伊登室(美國CELLBIOLABS公司)；CSMD1(前期實驗獲得)；人黑色素瘤A375細胞株(美國菌種收集中心MD)；DMEM培養(yǎng)基(美國GBICO公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；TUNEL試劑盒、碘化丙碇、DAPI、凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；Lipofectamine 2000 (美國INVITROGEN公司)；RNaseA、多聚甲醛(美國SIGMA公司)；結(jié)晶紫(上海碧云天公司)染色。

1.2 A375細胞培養(yǎng) 將A375細胞接種于DMEM培養(yǎng)基，其中含胎兒牛血清和抗生素(100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。選取第4～8代細胞。

1.3 質(zhì)粒建立和轉(zhuǎn)染 將前期實驗獲得的CSMD1基因用HindⅢ酶切，并插入到哺乳類表達載體pCDNA-3.0中，形成pCDNA-3.0-CSMD1。依照產(chǎn)品說明書，用Lipofectamine 2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入A375細胞。pCDNA-3.0轉(zhuǎn)染作為對照。分別采用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 MTT法檢測 將未轉(zhuǎn)染的(A組)、pCDNA-3.0轉(zhuǎn)染的(B組)以及 pCDNA-3.0-CSMD1轉(zhuǎn)染的(C組)A375細胞，分別置于96孔的培養(yǎng)皿中(每孔1500個細胞)，在標準條件下培養(yǎng)。12 h后，用0.5 mg/ml MTT處理細胞4 h，然后用二甲基亞砜(DMSO)溶解細胞。用微孔盤讀取儀測定吸光度為550～560 nm。

1.5 細胞周期分析 將細胞以1500 g的速度離心5 min，置于900 μl冷乙醇(70%)和100 μl PBS液的混合液中，冷藏1 h。細胞2次離心后，置于100 μl含RNaseA (0.2 mg/ml)的PBS液中，室溫下存放30 min。細胞再次離心后，置于350 μl含碘化丙碇(50 μg/ml)的PBS液中行PI染色，用流式細胞儀進行FACS分析。

1.6 DAPI染色分析 將細胞以1×105/孔的密度在標準培養(yǎng)條件下保存于6孔板中。每孔中加入4%多聚甲醛，15 min后，行DAPI染色，以檢測凋亡細胞。用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7 凋亡細胞的測定 在轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，依據(jù)凋亡檢測試劑盒說明書進行Annexin-V/FITC和PI雙染。用CellQuest軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.8 Transwell細胞遷移實驗 遷移實驗利用博伊登室(8 μm孔徑聚碳酸酯膜)進行。細胞懸浮于含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液中，濃度為3×105/ml。上室裝載100 μl細胞懸液，下室裝載600 μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基質(zhì)。在標準條件下培養(yǎng)12 h后，沒有發(fā)現(xiàn)任何細胞漂浮于上室，表明此時細胞并沒有發(fā)生凋亡。用棉簽除去膜上層的細胞，將遷移至膜下層的細胞固定于4%多聚甲醛，用結(jié)晶紫染色。隨機選擇10個視野(400×)，用光學(xué)顯微鏡計數(shù)細胞。每個實驗步驟重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，其結(jié)果的比較采用t檢驗(單側(cè)，不配對)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

MTT法檢測顯示，C組細胞的增殖率明顯低于A組和B組(P<0.05，圖1)；細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，C組細胞處于G1期的比例高于其他兩組(P<0.05，圖2)；DAPI染色分析發(fā)現(xiàn)，僅在C組細胞發(fā)現(xiàn)凋亡細胞核固縮，并在48 h內(nèi)出現(xiàn)核碎裂(圖3)；Annexin-V/FITC和PI雙染檢測結(jié)果顯示，C組細胞凋亡率為32.7%，明顯高于A組(6.6%)和B組(8.4%)細胞(P<0.05，圖4)；Transwell細胞遷移實驗發(fā)現(xiàn)，與A組細胞和B組細胞相比，C組細胞較少遷移至聚碳酸酯膜下層(P<0.05，圖5)。

3 討論

黑色素瘤是由來源于神經(jīng)嵴黑色素細胞的無限增殖并惡性轉(zhuǎn)化所形成的一種高度惡性皮膚腫瘤，是遺傳、環(huán)境等多種因素共同作用的結(jié)果。雖然發(fā)生率僅占皮膚惡性腫瘤的4%，但其死亡率卻占因皮膚惡性腫瘤死亡率的80%。英國最新的一項研究報道稱，目前惡性黑色素瘤(最危險的一種皮膚腫瘤) 患者10年生存率超過80%，而在19世紀70年代，該病的10年生存率只有50%左右。其原因很可能是由于目前該病治療水平的提高和癥狀的較早發(fā)現(xiàn)[5]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征，同時也是惡性腫瘤的致死原因，是影響黑色素瘤生存的首要因素，同時也是治療的最大障礙[6]。

研究表明，同其他腫瘤一樣，黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個涉及多層面、多步驟、多因素的極為復(fù)雜過程，包括癌基因的激活、抑癌基因活性減弱或消失，最終引起細胞活性的改變。本實驗在CSMD1對黑色素瘤細胞活性的影響方面，進行了較為全面的研究。CSMD1基因定位于8p23.1，其表達降低已被證實與許多癌癥相關(guān)，例如頭頸部鱗狀細胞癌[7]、前列腺癌[8]、結(jié)直腸癌[1]、卵巢癌[2]、乳腺腫瘤[9]和肝癌[10]，但CSMD1在黑色素瘤中的作用還未被證實過。前期實驗中，我們發(fā)現(xiàn)黑色素瘤中CSMD1 mRNA和蛋白的表達水平低于正常細胞，提示CSMD1可能是黑色素瘤的抑制基因。本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)pCDNA-3.0-CSMD1轉(zhuǎn)染的A375細胞的增殖及遷移能力明顯下降，并多數(shù)停滯在G1期，而且凋亡明顯增加，即外源性CSMD1可以降低黑色素瘤A375細胞的活性。

圖1 細胞生長曲線圖2 細胞周期分布圖3 細胞核形態(tài)學(xué)變化(綠色箭頭示核固縮；白色箭頭示核碎裂)圖4 細胞凋亡率圖5 Transwell細胞遷移實驗結(jié)果 a.膜下層細胞組織學(xué)觀察 b.細胞遷移率

Fig1 The cell growth curve.Fig2 The cell circle distribution.Fig3 Morphological changes of the nucleus (blue arrow shows the karyopyknosis, white arrow shows the karyorrhexis).Fig4 The apoptosis rate.Fig5 The result of transwell assays. a. histological view of lower cells. b. the migration rate.

上述結(jié)果表明，CSMD1在黑色素瘤中具有抗腫瘤作用，有望成為黑色素瘤新的分子標志物；早期檢測CSMD1的變化，對黑素瘤的早期診斷及早期治療，具有借鑒價值，也可能提供新的治療策略。但本實驗僅為體外實驗，所得結(jié)論還需要進一步的體內(nèi)實驗加以驗證。同時，CSMD1在黑色素瘤中的抗腫瘤作用機制還有待于進一步研究。

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EffectsofexogenousCSMD1onactivityofA375melanomacells

SUNQiang,GUOShu,TANGMing-rui,etal.
(DepartmentofPlasticSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

ObjectiveTo study the activity of pCDNA-3.0-CSMD1 transfected A375 cells, and investigate effects of exogenous CSMD1 on activity of A375 melanoma cells.MethodsThe cultured A375 melanoma cells and CSMD1 gene which obtained by prevenient experiments were used to construct the plasmid and transfected A375 cells. The A375 cells were divided into the A group (the cells without transfection), the B group (the cells transfected with pCDNA-3.0) and the C group (the cells transfected with pCDNA-3.0 and CSMD1). The activity of A375 cells was detected with MTT assay, cell cycle analysis, measurement of apoptotic cell death (DAPI staining assay, Annexin-V FITC/PI double staining assay, Transwell migration assay) and the statistical analysis aws also performed.ResultsThe rate of cell proliferation in the C group was lower than those in the other groups (P<0.05), and its proportion of G1 phase was higher (P<0.05). Apoptotic nuclear condensation with nuclear fragmentation was only observed in the C group within 48 hours. The percentage of apoptosis in the C group was 32.7 %, which was significantly higher compared to Group A (6.6 %) and Group B (8.4%),P<0.05. The cells in the C group significantly less migrated to the lower membrane compared to cells in the A and B groups (P<0.05).ConclusionExogenous CSDM1 can inhibit activity of melanoma A375 cells, and may provide a novel target for clinical treatment.

CSMD1; Melanoma; A375 cell

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.10.021

R619.6

A

1673-7040(2014)10-0638-03

2014-07-29)

110001 遼寧 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形外科

孫 強(1984-)，男，遼寧人，主治醫(yī)師，碩士.

郭 澍，110001，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形外科，電子信箱：guoshu67@sohu.com