LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定四逆湯中11個(gè)有效成分

繆 萍，裘福榮，曾 金，李秋月，沈淑嬌，賀 敏，王猛猛，蔣 健(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203)

四逆湯為東漢名醫(yī)張仲景之名方，始載于《傷寒論》，全方由生附子、干姜和炙甘草組成，具有回陽(yáng)救逆之效，主治少陰病如四肢厥逆、下利清谷、嘔吐腹痛、苔白滑、脈沉遲或細(xì)微等癥。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，四逆湯具有強(qiáng)心、升壓、抗休克、抗心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化和提高免疫功能等作用［1-6］，且全方合用效果明顯優(yōu)于各單味藥或任意兩兩組合，維持時(shí)間持久。烏頭類(lèi)生物堿、姜酚、甘草皂苷和甘草黃酮是四逆湯中的主要有效成分［7］。烏頭類(lèi)生物堿以C19雙酯型二萜類(lèi)生物堿 (烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿)毒性最強(qiáng)，易導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常、呼吸抑制和休克。故臨床上使用附子需經(jīng)過(guò)炮制，將劇毒性的雙酯型二萜生物堿水解為毒性較小的單酯型(苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿)及毒性更小的醇胺型 (烏頭原堿、新烏頭原堿和次烏頭原堿)生物堿［8］。姜酚是干姜的主要活性成分，具有強(qiáng)心、改善血液循環(huán)、降血脂和抗氧化的作用［9］。甘草主要含甘草酸、甘草次酸等三萜皂苷類(lèi)以及甘草苷、甘草素等黃酮類(lèi)成分，對(duì)心血管疾病有廣泛的治療作用［10］。而《中國(guó)藥典》2010年版一部?jī)H以甘草酸作為四逆湯的成分定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)［11］，未對(duì)其他活性成分進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本研究建立了液相-質(zhì)譜聯(lián)用 (LC-MS/MS)色譜法同時(shí)測(cè)定四逆湯中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、次烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的量的方法，可為其質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ABI 4000Q-Trap質(zhì)譜儀 (美國(guó)ABI/SCIEX公司)，配有電噴霧離子化源 (ESI)、三級(jí)四極桿質(zhì)量分析器以及Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件;日本島津LC-20A超高速液相色譜儀;Beckman Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) (美國(guó)Beckman公司);XS-105電子天平 (瑞士Mettler Toledo公司);Millpore純水機(jī) (美國(guó)Millipore公司);Thermo超低溫冰箱 (美國(guó)Thermo公司)。

1.2 試藥 生附子購(gòu)自安徽亳州藥材公司，干姜和炙甘草均購(gòu)自上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院魏莉副研究員鑒定分別為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖及豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖。新烏頭堿 (批號(hào)110798-200805)、次烏頭堿 (批號(hào)110799-201106)和地西泮 (批號(hào)115-9302)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;烏頭堿 (批號(hào)20120211)、苯甲酰烏頭原堿 (批號(hào)20130105)、苯甲酰新烏頭原堿 (批號(hào)20121210)、苯甲酰次烏頭原堿 (批號(hào)20121210)、烏頭原堿 (批號(hào) 20121210)和甘草酸 (批號(hào)20120910)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;甘草苷 (批號(hào)ZL20120219GCG)和6-姜酚 (批號(hào)ZL20120422JF)均購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。次烏頭原堿 (批號(hào)MUST-13061403)購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司。除次烏頭原堿 (純度≥90%)外，其余對(duì)照品純度均≥98%。甲醇、乙腈 (色譜純)購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司;其他試劑均為分析純。水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相 A為含4 mmol/L乙酸銨和0.08%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫 (0～1 min，40%B;1～4 min，40%B～90%B;4～9 min，90%B;9.5～16 min，40%B)。體積流量0.8 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30℃。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 (ESI)，正離子掃描，離子源噴霧電壓 (IS)3000 V，離子化溫度(TEM)500℃，噴霧氣壓 (GS1)60 psi(1 psi=6.895 kPa)，輔助氣壓 (GS2)60 psi。多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式。11種被測(cè)成分的離子對(duì)、去簇電壓 (DP)、碰撞能量 (CE)和碰撞室射出電壓(CXP)見(jiàn)表1。

表1 四逆湯中11種指標(biāo)成分的離子對(duì)和主要質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Optimized structures parameters of eleven components in Sini Decoction

2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿和次烏頭原堿適量，加入乙腈溶解并定容，搖勻，即得貯備液，－20℃冷藏備用。

精密稱(chēng)取甘草苷、甘草酸和6-姜酚適量，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃冰箱保存。

用乙腈溶解地西泮，制成質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，并用乙腈稀釋至2.5 ng/mL。

2.4 四逆湯煎煮液的制備 依照《中國(guó)藥典》2010年版中四逆湯處方比例，取各味飲片 (生附子30 g，干姜20 g，炙甘草30 g)，加8倍量水，浸泡30 min，水沸后再煎30 min，趁熱過(guò)濾，藥渣加入6倍量水，同法煎煮30 min，合并兩次濾液，減壓濃縮至1 mL含0.2 g生藥。平行制備3個(gè)批次，批號(hào)分別為20130921、20130923、20130925。4℃冰箱冷藏備用。將制得的湯劑至離心機(jī)中10000 r/min離心 10 min。

各樣品進(jìn)樣分析前，與2.5 ng/mL地西泮內(nèi)標(biāo)乙腈溶液按體積比1∶3渦旋混合30 s，離心(10000 r/min)10 min，0.45 μm 的微孔濾膜濾過(guò)，按“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)下條件分析。

2.5 陰性對(duì)照溶液的制備 按配伍劑量及供試品溶液制備方法制備同時(shí)不含生附子、干姜、炙甘草的陰性對(duì)照溶液。

2.6 專(zhuān)屬性 在該實(shí)驗(yàn)條件下，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、四逆湯煎煮液及陰性對(duì)照溶液各10 μL進(jìn)樣，結(jié)果顯示陰性對(duì)照溶液未檢測(cè)到干擾成分，按出峰順序11種成分烏頭原堿、次烏頭原堿、甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、甘草酸、烏頭堿、次烏頭堿、6-姜酚和內(nèi)標(biāo) (地西泮)的保留時(shí) 間 分 別 為 1.57、1.59、1.75、2.17、2.53、2.81、 3.68、 3.90、 5.05、 5.27、 7.77、8.14 min。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密量取各對(duì)照品溶液適量，用乙腈稀釋成系列混合對(duì)照品溶液 (烏頭堿、新烏頭堿的質(zhì)量濃度均為0.01、0.025、0.075、0.1、0.3、1、2.5 ng/mL;次烏頭堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿和次烏頭原堿的質(zhì)量濃度均為0.1、0.25、0.75、1、3、10、25 ng/mL;苯甲酰烏頭原堿的質(zhì)量濃度為 0.05、0.125、0.375、0.5、1.5、5、12.5 ng/mL;苯甲酰新烏頭原堿的質(zhì) 量 濃 度 為 0.2、0.5、1.5、2、6、20、50 ng/mL;甘草苷的質(zhì)量濃度為 6、15、45、60、180、600、1500 ng/mL;甘草酸的質(zhì)量濃度為10、25、75、100、300、1000、2500 ng/mL;6-姜酚的質(zhì)量濃度為 4、10、30、40、120、400、1000 ng/mL)，按“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)下條件分析，以對(duì)照品質(zhì)量濃度 (X)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積As與內(nèi)標(biāo)峰面積Ais的比值 (Y)為縱坐標(biāo)，作加權(quán)線(xiàn)性回歸計(jì)算，結(jié)果表明各成分在相應(yīng)的線(xiàn)性范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好 (見(jiàn)表2)。

圖1 11種混合對(duì)照品 (A)、四逆湯樣品溶液 (B)和陰性供試品溶液 (C)的LC-MS/MS色譜圖Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of reference substances(A)，Sini Decoction(B)and negative samples(C)

表2 四逆湯中11種化學(xué)成分的線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients and quantitation limits of eleven components in Sini Decoction

2.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液 (含烏頭堿、新烏頭堿均為0.30 ng/mL，次烏頭堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿和次烏頭原堿均為3.0 ng/mL，苯甲酰烏頭原堿為1.5 ng/mL，苯甲酰新烏頭原堿為6.0 ng/mL，甘草苷180 ng/mL，甘草酸300 ng/mL，6-姜酚120 ng/mL)，按“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣5次，將峰面積比值代入當(dāng)天標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度，求得精密度，結(jié)果表明儀器精密度良好，烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、新烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和 6-姜酚的 RSD值分別為 2.1%、2.7%、2.8%、4.0%、3.5%、4.1%、3.3%、2.4%、4.0%、3.6%、1.7%。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批四逆湯樣品，平行取樣6份，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)下條件分析，測(cè)定各化合物的量，結(jié)果烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、新烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的 RSD值分別為 1.9%、3.1%、2.8%、4.3%、5.5%、5.0%、3.3%、2.2%、3.0%、2.6%、1.4%，表明方法重復(fù)性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取四逆湯同一供試品溶液在室溫下放置 0、2、4、8、12 h，按 “2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算，結(jié)果烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、新烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的RSD值分別為3.8%、2.2%、2.0%、4.0%、1.9%、1.8%、3.5%、2.0%、1.7%、0.92%、2.0%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 回收率試驗(yàn) 精密量取已知11種成分含有量的四逆湯水煎液，平行6份，分別加入上述混合對(duì)照品溶液適量 (每1 mL含烏頭堿1.25 ng、新烏頭堿3.12 ng、次烏頭堿46.1 ng、苯甲酰烏頭原堿14.9 ng、苯甲酰新烏頭原堿110 ng、苯甲酰次烏頭原堿52.4 ng、烏頭原堿3.32 ng、次烏頭原堿5.93 ng、甘草苷2501 ng、甘草酸4252 ng、6-姜酚755 ng)，按照“2.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、次烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的平均回收率為 103%、96.2%、101%、95.4%、 97.0%、 98.3%、 96.7%、 95.7%、99.4%、98.3%、100%，RSD分別為 2.1%、1.8%、1.3%、2.4%、3.5%、0.82%、1.5%、2.4%、2.7%、1.9%、2.3%，表明各成分加樣回收率良好。

2.12 樣品測(cè)定 精密吸取3個(gè)批次的四逆湯樣品，每批樣品平行測(cè)定 3次，按“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)下條件分析測(cè)定，以?xún)?nèi)標(biāo)法計(jì)算各成分的量。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

四逆湯是一首組方簡(jiǎn)單、療效確切的經(jīng)典方，臨床應(yīng)用廣泛。由于中藥復(fù)方是復(fù)雜體系，經(jīng)多成分多途徑協(xié)同作用而發(fā)揮藥效，因此建立多組分同時(shí)定量的分析方法，對(duì)全面控制四逆湯的質(zhì)量具有重要的意義。

表3 3個(gè)批次四逆湯中11種成分的測(cè)定結(jié)果(ng·mL －1，，n=3)Tab.3 Contents of eleven components in Sini Decoction(ng·mL－1，，n=3)

表3 3個(gè)批次四逆湯中11種成分的測(cè)定結(jié)果(ng·mL －1，，n=3)Tab.3 Contents of eleven components in Sini Decoction(ng·mL－1，，n=3)

頭原堿20130921 0.54±0.02 1.33±0.13 19.2±1.44 6.35批號(hào) 烏頭堿 新烏頭堿 次烏頭堿 苯甲酰烏±0.3620130923 0.62±0.01 1.42±0.09 18.0±1.32 5.72±0.2820130925 0.46±0.01 1.24±0.05 18.0±1.15 6.87±0.24批號(hào) 苯甲酰新烏頭原堿苯甲酰次烏頭原堿 烏頭原堿 次烏頭原堿20130921 45.0±2.54 21.8±0.87 1.33±0.09 2.41±0.2020130923 46.4±1.84 19.6±0.64 1.26±0.07 2.58±0.1620130925 48.4±1.95 20.4±1.05 1.21±0.06 2.64±0.14批號(hào) 甘草苷 甘草酸 6-姜酚20130921 1040±4.33 1742±5.26 320±3.2620130923 997±3.12 1800±5.55 324±2.2020130925 1024±3.56 1796±4.67 317±3.32

既往文獻(xiàn)對(duì)四逆湯的活性成分大多采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，要求各種成分色譜峰完全分離，分析時(shí)間較長(zhǎng)，多在30 min左右，并且最小檢測(cè)質(zhì)量濃度均在5 μg/mL以上［12-15］。而串聯(lián)質(zhì)譜法 (MS/MS)專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，不要求各種成分色譜峰完全分離，快速高效。實(shí)驗(yàn)采用水提的方法對(duì)藥材進(jìn)行處理，而未采用《中國(guó)藥典》中所述氨水潤(rùn)濕后以異丙醇-二氯甲烷 (1∶1)混合液溶解提取的方法，主要是考慮到此方法只是單純的針對(duì)附子雙酯型生物堿而言，而本課題主要應(yīng)用于四逆湯方劑研究，所以采用煎煮法，保證與傳統(tǒng)給藥方案的一致性。本實(shí)驗(yàn)所建的色譜條件相對(duì)溫和，梯度洗脫，以乙腈-水為流動(dòng)相，可以有效降低系統(tǒng)壓力。而且由于烏頭類(lèi)生物堿具有弱堿性，所以在水相中加入4 mmol/L乙酸銨和0.08%甲酸，能夠明顯緩解烏頭堿的拖尾現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)對(duì)各個(gè)成分的分離。

本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS法，對(duì)四逆湯中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、次烏頭原堿、甘草苷、甘草酸和6-姜酚進(jìn)行同時(shí)定量分析，范圍涵蓋方劑中全部藥味。該方法分離效果理想，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率均符合測(cè)定要求，耗時(shí)短，并且最低定量限為0.01 ng/mL，可用于活性成分含有量較低的相關(guān)研究，有利于進(jìn)一步完善四逆湯的質(zhì)量控制及相關(guān)研究。

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