彭 佩，林愛(ài)華*，陳 軍，王 詠，顧 薇

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510120;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046)

馬錢子又名番木鱉，始載于《本草綱目·卷十八》，為馬錢科植物馬錢 (Strych nosnux-vomica L.)的干燥成熟種子，馬錢子具有明顯的體外抗腫瘤作用，總生物堿是馬錢子的有效部位，馬錢子總生物堿在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞株均具有抑制作用［1］。

隱形脂質(zhì)體是利用二硬脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行表面修飾來(lái)提高其親水性，其有效的避免了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細(xì)胞的攝取，使脂質(zhì)體具有了腫瘤靶向性從而改善藥效［2-3］，陳斯?jié)傻鹊难芯勘砻鳎珼SPE-PEG2000修飾的抗腫瘤化療藥鹽酸洛拉曲克脂質(zhì)體與普通脂質(zhì)體相比顯示了較好的體外長(zhǎng)效毒性［4］。而前期研究已經(jīng)表明，采用復(fù)合磷脂組成能明顯的改善馬錢子總生物堿的藥劑學(xué)性質(zhì)［5］，但不同磷脂組成的隱形脂質(zhì)體的腫瘤細(xì)胞攝取特性與抗腫瘤作用還有待于進(jìn)一步比較研究。

本實(shí)驗(yàn)選取人肝癌SMMC-7721細(xì)胞為模型，考察不同磷脂組成的隱形脂質(zhì)體對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性和攝取影響，初步探討其作用機(jī)制，為肝癌靶向脂質(zhì)體的設(shè)計(jì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

LC-20AT高效液相色譜儀 (RF-10AXL熒光檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器，日本島津);紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限責(zé)任公司);流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司，美國(guó));CO2培養(yǎng)箱(thermo scientificforma，美國(guó));酶標(biāo)儀 (Bio-Rad公司，美國(guó));納米粒徑測(cè)定儀Zetasizer(PCS3000型，英國(guó)馬爾文公司);JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE252AA型，上海亞榮生化儀器廠);TGL-16G高速離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠);BS124S電子天平 (德國(guó)賽多利斯公司);HL-2S恒流泵 (上海滬西分析儀器廠有限公司);THZ-82型水浴恒溫振蕩器 (江蘇金壇億通電子有限公司);DF-101SA集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (南京科爾儀器設(shè)備有限公司)。

香豆素-6(美國(guó)Sigma-Aldrich，純度≥98.0%);膽固醇 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);大豆磷脂 (SPC)、氫化大豆磷脂 (HSPC)、二硬脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000，純度＞98%)均為德國(guó) Lipoid公司提供;透析袋(USA，MW:8000～14000);SMMC-7721細(xì)胞(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);RPMI1640、胎牛血清、PBS、胰酶、青霉素和鏈霉素、MTT均為 (Gibco，美國(guó));SephadexG-50(Pharmacia公司，進(jìn)口分裝);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 馬錢子總生物堿的提取與成分分析 稱取制馬錢子粉末100 g，15倍量的70%乙醇，回流提取3次，每次0.5 h，濾紙過(guò)濾后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮濾液，用200 mL的1 mol/L鹽酸超聲溶解，4000 r/min離心10 min，取上清液，然后用40%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 12.0，再用二氯甲烷萃取后合并，減壓回收二氯甲烷，即得馬錢子總生物堿提取物，用氯仿溶解馬錢子總生物堿提取物配成1 mg/mL的溶液，稀釋到一定的質(zhì)量濃度，按2010年版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定的方法［6］采用HPLC測(cè)定馬錢子堿和士的寧的量，結(jié)果表明，在總生物堿提取物中，士的寧占36.9%，馬錢子堿占23.9%(n=10)。

2.2 馬錢子總生物堿隱形脂質(zhì)體的制備 采用硫酸銨梯度法制備，按一定比例稱復(fù)合磷脂SPC/HSPC=3∶1(摩爾比)、膽固醇、隱形材料DSPEPEG2000(占磷脂總用量的5%摩爾比)，加入一定量的無(wú)水乙醇超聲溶解，注入到0.2 mol/L硫酸銨溶液中，60℃磁力攪拌45 min除去乙醇后用探頭超聲勻化，用pH 7.4 PBS(10倍體積，透析4次，每次1h)透析除去外水相硫酸銨，既得空白隱形脂質(zhì)體。按1∶6藥脂質(zhì)量比取馬錢子總生物堿與空白復(fù)合磷脂隱形脂質(zhì)體混合，60℃恒溫水浴振蕩20 min載藥，即得。同法制得大豆磷脂、氫化大豆磷脂單一磷脂脂質(zhì)體。

2.3 粒徑與電位測(cè)定 取復(fù)合磷脂、大豆磷脂和氫化大豆磷脂脂質(zhì)體，用pH7.4 PBS稀釋至適宜濃度，用Zetasizer測(cè)定儀測(cè)定粒徑與電位。復(fù)合磷脂馬錢子總生物堿隱形脂質(zhì)體的平均粒徑明顯小于馬錢子總生物堿大豆磷脂隱形脂質(zhì)體和馬錢子總生物堿氫化大豆磷脂隱形脂質(zhì)體平均粒徑，并且3種不同磷脂組成脂質(zhì)體表面電位均無(wú)明顯差異且都為中性。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同磷脂的馬錢子總生物堿脂質(zhì)體的粒徑、多分散系數(shù)與電位 (n=3)Tab.1 Particle size and polydispersity index or potential of various phospholipids composition total alkaloid liposomes(n=3)

2.4 脂質(zhì)體的包封率測(cè)定［7］

2.4.1 色譜條件 LichrospherC18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)(江蘇漢邦科技有限公司);流動(dòng)相為乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合液 (10%磷酸調(diào)pH 2.8)(24∶76);檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;體積流量為1 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量20μL。

2.4.2 馬錢子堿與士的寧標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取馬錢子堿與士的寧貯備液適量，用甲醇配制成1.0、5、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL 的系列溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以馬錢子堿和士的寧質(zhì)量濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，分別得到回歸方程為:Y=17379X－210.75(r=0.9999)Y=17060X+80.478(R=0.9999)。結(jié)果表明，馬錢子堿與士的寧在質(zhì)量濃度為1.0～100.0 μg/mL內(nèi)與峰面積均具有良好的線性關(guān)系。

2.4.3 成分含量測(cè)定 分別精密吸取0.5 mL 3種以上不同磷脂組成馬錢子總生物堿隱形脂質(zhì)體過(guò)SepHadexG-50柱 (1 cm×27 cm)，用 pH7.4 PBS洗脫，分離出脂質(zhì)體部分和未包封的游離藥物，用甲醇稀釋脂質(zhì)體部分破膜，4000 r/min離心，用“2.4.1”項(xiàng)的方法測(cè)定其中馬錢子堿和士的寧的量，用紫外分光光度法測(cè)定馬錢子總生物堿的量［8］。計(jì)算馬錢子堿和士的寧的包封率。結(jié)果見(jiàn)表2。3種不同磷脂組成脂質(zhì)體中的士的寧成分與馬錢子堿成分的包封率均相差不大，并且與用紫外分光光度法測(cè)得的其馬錢子總生物堿包封率相差也不大。

包封率 =脂質(zhì)體中藥物含量 /(脂質(zhì)體中藥物含量 +游離藥物的量)×100%

表2 3種磷脂馬錢子總生物堿脂質(zhì)體的包封率比較 (n=3)Tab.2 Encapsulating efficiency of various phospholipids composition total alkaloid liposomes(n=3)

2.5 不同磷脂組成馬錢子總生物堿隱形脂質(zhì)體的體外抗腫瘤比較

2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)。

2.5.2 種板與給藥 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞以4×103個(gè)/孔與96孔板中，放置24 h后，用紫外分光光度法測(cè)定上述3種除去游離藥物的馬錢子總生物堿隱形脂質(zhì)體與馬錢子總生物堿溶液的藥物含有量，用培養(yǎng)基調(diào)整到藥物的質(zhì)量濃度一致 (120、60、30、15、7.5 μg/mL)，分別加入與上述 3種馬錢子總生物堿隱形脂質(zhì)體與馬錢子總生物堿溶液100 μL，每個(gè)藥物做4個(gè)復(fù)孔，放置24 h后加入5 mg/mL的MTT，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h后加入150 μL的DMSO，振蕩溶解10 min，酶標(biāo)儀中測(cè)定OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)為499 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)圖1，馬錢子總生物堿溶液、復(fù)合磷脂隱形脂質(zhì)體、大豆磷脂隱形脂質(zhì)體、氫化大豆磷脂隱形脂質(zhì)體的IC50分別為64.4、17.8、29.6、40.9 μg/mL。3 種脂質(zhì)體的體外抗肝癌效果都要高于馬錢子總生物堿溶液 (P＜0.05)，復(fù)合磷脂隱形脂質(zhì)體的體外肝癌細(xì)胞抑制率明顯的高于大豆磷脂與氫化大豆磷脂隱形脂質(zhì)體 (P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。

圖1 不同磷脂馬錢子總生物堿隱形脂質(zhì)體對(duì)SMMC-7721的抑制率Fig.1 Antitumor of various phospholipids composition total alkaloid liposomes to SMMC-7721

2.6 SMMC-7721對(duì)香豆素-6不同磷脂組成隱形脂質(zhì)體的攝取量比較

2.6.1 載香豆素-6不同磷脂組成脂質(zhì)體的制備［9-10］按一定質(zhì)量比稱取磷脂 (大豆磷脂、氫化大豆磷脂或復(fù)合磷脂大豆磷脂-氫化大豆磷脂為3∶1摩爾比)、膽固醇、隱形材料 DSPE-PEG2000(占磷脂總用量的5%摩爾比)和香豆素-6溶于適量氯仿中，55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空除去CHCl3得均勻薄膜，真空干燥過(guò)夜后加入pH 7.4的PBS緩沖液5 mL，37℃恒溫水合1 h后，探頭超聲50次，采用SephadexG-50柱 (1 cm×27 cm)將香豆素-6脂質(zhì)體的脂質(zhì)體部分和游離香豆素-6分離，即得。

2.6.2 香豆素-6標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立色譜條件［11］Hibar C18色譜柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm);檢測(cè)器為RF-10AXL熒光檢測(cè)器;流動(dòng)相為水-甲醇(5∶95);體積流量為0.8 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;激發(fā)波長(zhǎng)Ex為466 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em為504 nm。精密吸取香豆素-6貯備液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的系列溶液。以香豆素-6質(zhì)量濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為:Y=121484.18X+20227.069(r=0.9994)。結(jié)果表明，香豆素-6在質(zhì)量濃度在0.50～20.0 ng/mL內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.6.3 按“2.6.1”項(xiàng)下的方法制備香豆素-6不同磷脂組成脂質(zhì)體，保證其初始脂質(zhì)濃度和熒光強(qiáng)度一致，將SMMC-7721以每孔2.5×105個(gè)的密度接種于6孔板內(nèi)，觀察細(xì)胞融合度在80%左右且細(xì)胞形態(tài)飽滿后，移去培養(yǎng)基，加入分離后的3種不同磷脂組成的香豆素-6隱形脂質(zhì)體，用“2.6.2”項(xiàng)的方法測(cè)定其中香豆素-6的含有量，用不含血清培養(yǎng)基調(diào)整香豆素-6的含有量 (20 ng/mL)，每孔加入2 mL，放到37℃CO2孵箱中共同孵育1 h后，用冷 PBS沖洗細(xì)胞3次，吸出PBS，加入0.4 mL胰酶，消化1 min，加入1 mL的培養(yǎng)基終止消化，吹打下細(xì)胞，1000 r/min，離心10 min，去掉上清液后加入PBS吹打均勻，重復(fù)3次，最后用PBS調(diào)成單細(xì)胞懸浮液，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度和轉(zhuǎn)染率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3，3種脂質(zhì)體的平均熒光強(qiáng)度和轉(zhuǎn)染率都有明顯的差異，其中香豆素-6 SPC隱形脂質(zhì)體和香豆素-6復(fù)合磷脂隱形脂質(zhì)體都與香豆素-6 HSPC隱形脂質(zhì)體有極顯著差異P＜0.01，香豆素-6 SPC隱形脂質(zhì)體與香豆素-6復(fù)合磷脂隱形脂質(zhì)體有顯著性差異P＜0.05，說(shuō)明復(fù)合磷脂隱形脂質(zhì)體與SMMC-7721細(xì)胞的作用要明顯的強(qiáng)于前兩者，作為抗腫瘤藥物的載體的選擇能更快的發(fā)揮藥效。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。

圖2 香豆素-6不同磷脂組成隱形脂質(zhì)體在SMMC-7721中的熒光強(qiáng)度Fig.2 Fluorescence intensity of various phospholipids composition of coumarin-6 liposome in SMMC-7721

圖3 不同磷脂組成香豆素-6隱形脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染率(n=3)Fig.3 Various phospholipids composition of coumarin-6 liposomes uptake rate(n=3)

3 討論

復(fù)合磷脂脂質(zhì)體技術(shù)作為新型的脂質(zhì)體技術(shù)，其特征是運(yùn)用不同相變溫度的磷脂材料作為膜材。研究表明［12］馬錢子總生物堿復(fù)合磷脂隱形脂質(zhì)體對(duì)荷瘤小鼠的抑制率明顯高于大豆磷脂脂質(zhì)體，本實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的體外腫瘤細(xì)胞攝取和抗腫瘤效果進(jìn)行了考察，結(jié)果表明復(fù)合磷脂脂質(zhì)體作為中藥抗腫瘤有效部位馬錢子總生物堿的載體能夠顯著增強(qiáng)抗腫瘤效果，腫瘤細(xì)胞的攝取增加是其增加抗腫瘤效果的重要機(jī)制。

熒光探針香豆素-6為一種脂溶性較好的激光染料，熒光效率與靈敏度都非常高，文獻(xiàn)［13］報(bào)道不同脂質(zhì)材料香豆素-6脂質(zhì)體在不同的pH條件下的累積滲漏率均不高于0.8%，證明香豆素-6是一種較為理想的熒光探針，因此本實(shí)驗(yàn)選擇香豆素-6作為熒光探針來(lái)用于脂質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)示蹤研究。

脂質(zhì)體與細(xì)胞的作用過(guò)程分為吸附、脂交換、內(nèi)吞、融合4個(gè)階段。其中，內(nèi)吞是脂質(zhì)體與細(xì)胞的主要作用機(jī)制，通過(guò)釋放藥物而影響細(xì)胞生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同磷脂脂質(zhì)體對(duì)SMMC-7721的生長(zhǎng)抑制率與細(xì)胞對(duì)其的攝取率趨勢(shì)一致，說(shuō)明不同磷脂的選擇對(duì)抗腫瘤的作用影響有著關(guān)鍵的作用，而復(fù)合磷脂隱形脂質(zhì)體的效果明顯優(yōu)于大豆磷脂與氫化大豆磷脂隱形脂質(zhì)體，這為其作為中藥馬錢子總生物堿抗腫瘤的載體的研究開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氫化大豆磷脂脂質(zhì)體的腫瘤細(xì)胞攝取率較低，其抗腫瘤效果也低于復(fù)合磷脂與大豆磷脂脂質(zhì)體，氫化大豆磷脂脂質(zhì)體的相變溫度在53℃［14］，在體溫下非常穩(wěn)定，因此體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)優(yōu)于大豆磷脂脂質(zhì)體。氫化大豆磷脂脂質(zhì)體的攝取率偏低可能是由于氫化大豆磷脂在37℃處于膠晶相，膜的流動(dòng)性低，不易與腫瘤細(xì)胞相互作用所致。

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