天津市寶坻區(qū)藥品檢驗(yàn)所(301800)尹立平 劉寶珠
脂降寧片由制何首烏、葛根等8味中藥及氯貝酸鋁等制成的復(fù)方制劑,具有降脂、活血通絡(luò)等作用,降低甘油三酯效果顯著。脂降寧片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第七冊(cè),只有制何首烏薄層鑒別及氯貝酸鋁的含量測定標(biāo)準(zhǔn),因此為了能更好地控制制劑質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)研究并建立脂降寧片中葛根(以葛根素計(jì))的HPLC含量測定方法。
1.1 儀器與試藥 島津LC-2010CHT高效液相色譜儀;梅特勒托利多天平AB265-S;島津UV-2401PC紫外可見分光光度儀;昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ5200E型超聲波清洗器;葛根素對(duì)照品(來源:中國藥品生物制品檢定所,批號(hào):110752-200912,含量:96.0%);脂降寧片(A廠批號(hào)為130901、B廠批號(hào)20121209、C廠批號(hào)20121001);陰性對(duì)照樣品市售藥材自制;乙腈為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純。
1.2 色譜條件 色譜柱:迪馬-platisil ODS C18(5μm,250×4.6mm);柱溫30℃;流動(dòng)相:乙腈-水(11:89);流速:1.0ml/min;進(jìn)樣量:10μl;檢測波長:250nm。
1.3 方法與結(jié)果
1.3.1 供試品溶液的制備 取本品10片,去糖衣,精密稱定,研細(xì),精密稱取細(xì)粉約0.3g,置具塞錐形瓶中,精密加70%甲醇溶液25ml,稱定重量,超聲處理30min,放冷,再稱定重量,用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量,搖勻,微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
附表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果
附圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線
附圖2 陰性樣品
附圖3 對(duì)照品
附圖4 樣品
1.3.2 陰性樣品溶液的制備 按處方配比及工藝自行制備陰性樣品,再按“供試品溶液制備”方法制備陰性樣品溶液。
1.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素對(duì)照品約12.5mg(對(duì)照品取量為13.45mg),置50ml量瓶中,加70%甲醇溶液適量超聲使溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取5ml置50ml量瓶中,加70%甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,即得(每1ml含葛根素0.025mg)。
1.3.4 線性及范圍 精密稱取葛根素對(duì)照品13.45mg,按“對(duì)照品溶液的制備”方法制得溶液(0.02582mg/ml),分別 進(jìn) 樣1、2、5、10、15、20、25、30μl,按上述色譜條件測定,以葛根素濃度mg/ml(0.02582、0.05165、0.1291、0.2582、0.3873、0.5165、0.6456、0.7746)為X軸,峰面積(108999、119011、599179、1176081、1779843、1431088、2966459、3558551)為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得葛根素線性回歸方程y=5E+06X-4840,r=0.9998,表明葛根素在0.02582~0.7746μg的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。見附圖1。
1.3.5 精密度試驗(yàn)(重復(fù)性) 取同一供試品(編號(hào)1)6份,精密稱定,按“供試品溶液的制備”方法制備溶液,依上述色譜條件進(jìn)行檢測,得峰面積分別為1127381、1127852、1127321、1128554、1126616、1125617,RSD=0.1%(n=6),表明該方法重現(xiàn)性好。
1.3.6 專屬性 將對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液按上述色譜條件測定,供試品溶液中葛根素峰與相鄰色譜峰分離度符合要求,陰性樣品無干擾。表明該方法專屬性強(qiáng)。見附圖2~4。
附表2 三個(gè)廠家樣品葛根素含量
1.3.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量(葛根素含量1.93mg/g)的脂降寧片(批號(hào)130901)細(xì)粉約0.15g,置具塞錐形瓶中,精密加入葛根素對(duì)照品溶液(濃度0.3228mg/ml)1ml,按“供試品溶液的制備”方法制備溶液,依上述色譜條件進(jìn)行檢測,計(jì)算回收率。見附表1。
1.3.8 樣品測定 取A、B、C三個(gè)廠家樣品,按“供試品溶液的制備”方法制備溶液,依上述色譜條件進(jìn)行檢測,計(jì)算葛根素的含量。見附表2。
1.3.9 穩(wěn)定性試 取同一供試品溶液,在室溫下分別放置0、1、2、3、4、5、6、7天后按“1.2色譜條件”測定,峰面積為1127381、1119701、1125539、1120390、1126348、1129331、1122018,RSD=0.3%,表明供試品溶液在7天內(nèi)穩(wěn)定。
2.1 吸收波長確定 配置0.01μg/ml的葛根素對(duì)照品甲醇溶液,用UV-2401PC型紫外分光光度儀在100~400nm范圍內(nèi)掃描,在249.9nm有最大吸收,故確定葛根素檢測波長為250nm。
2.2 供試品溶液制備 分別采用乙醇、甲醇、70%甲醇等溶媒進(jìn)行超聲10、30、40min等不同方法對(duì)供試品進(jìn)行提取,經(jīng)篩選以70%甲醇超聲提取30min效果最好。
2.3 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)中曾選用甲醇-水,甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相,甲醇-水峰型不好,甲醇-0.1%磷酸溶液對(duì)色譜柱適用性差。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-水(11∶89)為流動(dòng)相效果最好。