不同產(chǎn)地石榴皮總黃酮含量及抗氧化活性比較研究

安徽省銅陵市食品藥品檢驗所（244000）錢世兵

安徽省銅陵職業(yè)技術(shù)學院（244000）開偉華Δ

伽藍(集團)股份有限公司（200233）金家宏 李慧 夏增華

石榴（Punica granmumLinn.）為石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica）落葉灌木或小喬木，別名安石榴、海榴，分布在亞熱帶及溫帶地區(qū)，我國南北各地區(qū)均有種植，其中陜西、安徽、山東、江蘇、河南、四川、云南及新疆等地分布較多。石榴皮為石榴的干燥果皮，秋季果實成熟后收集果皮，曬干；性溫，味酸、澀，歸大腸經(jīng)，具有澀腸，止血，驅(qū)蟲等功效?？芍尉脼a，久痢，便血，脫肛，滑精，蟲積腹痛，疥癬等。臨床用于腹瀉、潰瘍性結(jié)腸炎等的治療[1][2][3]。

研究顯示，石榴皮提取物含有高達24.9%的多酚類化合物，其中類黃酮物質(zhì)占6%，而黃酮類化合物因在抗衰老等方面具有良好的作用，具有清除自由基和抗氧化的能力而備受關(guān)注[4]，且已被證實與石榴皮中抗氧化作用有關(guān)[5]。為了發(fā)掘更好的石榴皮藥用資源，本研究采用三氯化鋁絡合法測定不同產(chǎn)地的石榴皮中總黃酮含量及其DPPH自由基清除作用，對不同產(chǎn)地、品種的石榴皮的抗氧化作用進行評價，以期為石榴資源的綜合開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 市售石榴，分別產(chǎn)自上海（鮮石榴）、陜西臨潼（酸石榴）、山東棗莊（鮮石榴）、新疆烏魯木齊（鮮石榴）、云南蒙自（干燥皮）、安徽懷遠（鮮石榴）、云南玉溪（酸石榴）、云南玉溪（鮮石榴）、安徽亳州（干燥皮）和上海（飲片，碳制）。新鮮石榴收集后，分離皮、果汁和種子，果汁濃縮至干，備用；石榴皮和種子60℃下鼓風干燥，粉碎至粗粉，保存于干燥避光處備用。

1.2 儀器 T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）、電子分析天平（Shimadzu）、鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、自動雙蒸純水蒸餾器（上海和泰儀器有限公司）、容量瓶、離心管、具塞試管。

1.3 試劑與配制

1.3.1 試劑 DPPH（二苯基苦味?；诫拢琒igma Aldrich）、Vc （分析純，上海駿惠化工有限公司）、槲皮素標準品（98%，Sigma Aldrich）、無水乙醇（分析純，中國上海振興化工一廠）、95%乙醇（分析純，中國上海振興化工一廠）、甲醇（分析純，中國上海振興化工一廠）；三氯化鋁（分析純，Sigma Aldrich）。

1.3.2 配制 DPPH乙醇溶液的配制：準確稱取6mg DPPH，用95%乙醇（或無水乙醇）溶解并定容于200ml容量瓶中，DPPH濃度為76μmol/L，避光保存（0～4℃）。

附表1 10種產(chǎn)地和來源石榴皮抗氧化活性結(jié)果

附表2 10種產(chǎn)地和來源石榴皮總黃酮含量

1.4 方法

1.4.1 抗氧化活性測定[6][7][8]

1.4.1.1 供試品制備 石榴皮提取物制備：取石榴皮粗粉20g，加70%乙醇按m（料）∶V（液）＝1∶10浸泡3h，超聲提取30min（500W），濾液濃縮至干，加適量水配置成10mg/ml母液，備用。

1.4.1.2 測定方法 取樣品溶液和DPPH·溶液按照等體積比加入同一具塞試管中，搖勻，在避光條件下反應30min后用分光光度計在525nm處測定吸光度T。同時測定DPPH溶液與等體積純水混合液的吸光度C，以及待測液與等體積95%乙醇混合液的吸光度T0。根據(jù)下列公式計算清除率：清除率＝[1-（T-T0）/C]×100%。同時，本實驗采用Vc作為對照組。

1.4.1.3 半清除率（IC50）的測定 半清除率指清除率為50%時所需樣品的濃度。將待測抗氧化劑配制成系列溶液，測定各濃度抗氧化劑對DPPH自由基清除率，在清除率0%～100%的范圍內(nèi)，繪制清除率對濃度曲線，計算出清除率為50%時的濃度值，即為IC50值。IC50越低，說明抗氧化活性越高。

1.4.2 總黃酮含量測定[9]

1.4.2.1 供試品制備 同1.4.1.1項下供試品制備。

1.4.2.2 對照品溶液的制備 槲皮素標準溶液：精密稱取在120℃干燥至恒重的槲皮素對照品10mg于100ml容量瓶中，用70%乙醇溶解稀釋定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液備用（每1ml含槲皮素0.1mg）。

1.4.2.3 測定方法 三氯化鋁顯色法：分別取石榴皮提取液和槲皮素對照品溶液各1ml于2支10ml具塞試管中，加入1ml 1%三氯化鋁（甲醇）液，甲醇定容，搖勻，15min后用在200～500nm波長范圍內(nèi)進行掃描，以不加顯色劑的溶液為空白。經(jīng)比較選擇以410nm處為最大吸收波長。

2 結(jié)果

2.1 石榴皮提取物抗氧化活性 10種產(chǎn)地的石榴皮提取物，按照1.4.1項下抗氧化活性測定方法，分別進行DPPH自由基清除實驗，結(jié)果見附表1。由附表1可見，不同產(chǎn)地的石榴皮的抗氧化活性存在明顯差異（IC50：5.1±1.0～19.2±1.8μg/ml）。其中，酸石榴（云南玉溪、陜西臨潼產(chǎn)）較其他石榴皮抗氧化活性強，并且以云南玉溪產(chǎn)酸石榴皮抗氧化活性最好；其他產(chǎn)地的石榴皮中，新疆烏魯木齊和安徽懷遠產(chǎn)石榴皮抗氧化活性最強，且與炮制后石榴皮飲片的抗氧化活性相當。

2.2 石榴皮提取物總黃酮含量 10種產(chǎn)地和來源的石榴皮提取物，按照1.4.2項下總黃酮含量測定方法，分別進行總黃酮含量的測定，結(jié)果見附表2。由附表2可以看出，不同品種、產(chǎn)地的石榴皮的總黃酮含量存在明顯差異（55.18～117.04mg/g），酸石榴皮中總黃酮含量最高，并且以云南玉溪與陜產(chǎn)酸石榴皮總黃酮含量最高；其他產(chǎn)地石榴皮中，以新疆烏魯木齊和安徽懷遠產(chǎn)石榴皮總黃酮含量較高。

3 討論

石榴作為藥食兩用植物，不但營養(yǎng)豐富，而且具有較為廣泛的藥用價值，在唐代《本草拾遺》及明代《本草綱目》中均有記載：石榴具有生津化食、抗胃酸過多、軟化血管、解毒的功能[10][11]；石榴皮均有抗菌、抗病毒的作用[12]，臨床用于腹瀉、潰瘍性結(jié)腸炎等的治療。

大量研究顯示，石榴含有多種生理活性成分，具有抗氧化、清除自由基、預防心腦血管疾病等多種功能，而作為占石榴20～30%的石榴皮還沒有得到充分的利用，大部分都被廢棄，造成嚴重的資源浪費。因此，石榴皮的合理開發(fā)對于石榴的開發(fā)具有重要意義。

通過本次研究可以發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的石榴皮在總黃酮含量以及抗氧化活性存在較大差異。此外，總黃酮含量較高的石榴皮抗氧化作用也較好，兩者呈正相關(guān)性。因此，總黃酮可能是石榴皮具有抗氧化活性的物質(zhì)基礎。

此外，筆者比較酸石榴和甜石榴的數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)自云南玉溪和陜西臨潼的酸石榴在總黃酮和抗氧化活性遠高于甜石榴。這也與當?shù)厮崾裰饕鳛樗幱孟嗷ビ∽C。尤其是云南玉溪產(chǎn)地的酸石榴其DPPH清除率的IC50達到0.005mg/ml，接近于公認的強抗氧化劑Vc（0.003mg/ml）。這也對酸石榴的進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

這一研究結(jié)果對于開發(fā)利用石榴皮提供了一定的參考依據(jù)。若利用這部分廢棄資源開發(fā)新型黃酮制劑，尤其是抗氧化劑的開發(fā)利用，可增加石榴的附加值，提高經(jīng)濟效益。