★ 楊賽琳 劉彩霞 舒艷 斯曉莉 丁俐文 傅華洲

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州310053;2.杭州市第一人民醫(yī)院 浙江杭州310006)

惡性腹水是多種癌癥晚期的臨床表現(xiàn)，與原發(fā)疾病密切相關(guān)，預(yù)后差，平均生存期約20周。臨床治療惡性腹水的方法頗多，如利尿、腹穿穿刺放液、全身或腹腔內(nèi)化療等，但均存在較大毒副作用，患者耐受性差。免疫治療及分子靶向治療成本較高，尚不適宜廣泛應(yīng)用于臨床［1-6］。因此開(kāi)發(fā)療效顯著、價(jià)格低廉的中藥及中成藥制劑有著廣泛的市場(chǎng)需求和應(yīng)用前景。人參二苓湯具有補(bǔ)氣健脾、燥濕利水等功效，組成藥物價(jià)格低廉、藥源廣泛，組方合理有效。前期的研究發(fā)現(xiàn)，人參二苓湯主要用于中醫(yī)在惡性腫瘤方面的維持治療，具有增效、減毒及改善患者生存質(zhì)量等作用［7-9］。本研究利用H22荷瘤小鼠惡性腹水模型篩選出人參二苓湯的有效部位的最佳劑量，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材 人參二苓湯藥材由杭州市第一人民醫(yī)院中藥房提供;替加氟片由山東齊魯制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑與儀器 試劑:石油醚(分析純，杭州大方化學(xué)試劑廠)，氯仿(分析純，衢州巨化試劑有限公司)，乙酸乙酯(分析純，杭州大方化學(xué)試劑廠)，正丁醇(分析純，杭州雙林化工試劑廠)，二甲基亞砜(DMSO)(分析純，杭州雙林化工試劑廠)，超級(jí)新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，細(xì)胞培養(yǎng)基1640(美國(guó)GIBCOBRL公司)，Elisa試劑盒(上海美軒生物技術(shù)有限公司)。

儀器:UV8500可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX71)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation HEPA CLASS100)，超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-201上海申順生物科技有限公司)，循環(huán)水式真空泵(SHZ-Ⅲ鞏儀市英峪予華儀器廠)，電子精密天平(AR2130 Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠60只，雌雄各半，體重18～22g，SPF 級(jí)，合格證號(hào)(SCXK 浙)2008-0033，購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心研究中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 H22荷瘤小鼠惡性腹水模型的建立 小鼠H22肝癌細(xì)胞株，離心棄上清。加入生理鹽水將細(xì)胞濃度調(diào)至1.0×107/mL。取0.5mL細(xì)胞懸液接種于小鼠腹腔內(nèi)。待小鼠出現(xiàn)腹水后(接種第7天)，斷頸處死小鼠，無(wú)菌條件下抽取腹水，放入離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，加入生理鹽水吹洗，再離心，共2次。再用生理鹽水稀釋腫瘤細(xì)胞懸液(1.0×106/mL)。取該懸液0.2mL/只，接種于適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后的60只小鼠腹腔，建立腹水瘤動(dòng)物模型［10，11］。

2.2 分組及給藥

2.2.1 分組 荷瘤小鼠造模24小時(shí)后，將動(dòng)物按體重隨機(jī)分為模型對(duì)照組，陽(yáng)性(替加氟)對(duì)照組，人參二苓湯有效部位低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各12只。

2.2.2 給藥 人參二苓湯先用70%乙醇浸提，浸膏采用水混懸，將浸膏懸溶于水，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到人參二苓湯的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取五個(gè)部位，根據(jù)前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，人參二苓湯正丁醇層為其有效部位，將人參二苓湯有效部位制備成每mL含生藥1.1g。按《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》附表“人和動(dòng)物間接體表面積折算表”，分別計(jì)算出3組用藥劑量，分別是 6.1g/kg，9.9g/kg，13.2g/kg，用生理鹽水稀釋成低、中、高劑量組所需濃度灌胃給藥，最后每組均給藥0.4mL/只。小鼠腹腔接種H22肝癌細(xì)胞株48小時(shí)后，人參二苓湯各劑量組開(kāi)始灌胃給藥0.4mL/只，陽(yáng)性對(duì)照組給予替加氟 0.4mL/只(120mg/kg)，模型對(duì)照組給予生理鹽水0.4mL/只。每日1次，連續(xù)給藥14天。

2.3 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 給藥期間觀察各組小鼠毛色、食欲、活動(dòng)狀況和精神狀態(tài)等一般的生活狀況。每天給藥前定時(shí)稱體重和測(cè)量腹圍，以及稱量各組每天消耗鼠糧的重量。

給藥第14天后停止治療，第15天觀察各組小鼠的生活狀態(tài)和體重，測(cè)腹圍。第16天處死全部小鼠。在無(wú)菌條件下用注射器抽取腹水，轉(zhuǎn)入﹣80℃冰箱保存，待指標(biāo)檢測(cè)。解剖死亡小鼠，觀察腹腔內(nèi)情況，計(jì)數(shù)腹膜瘤結(jié)節(jié)數(shù)量并稱重，計(jì)算抑瘤率。取出的腹膜瘤體放入Eppendorf管，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，待進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

抑瘤率(%)=［(對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重］×100%

2.4 Elisa檢測(cè)腹水中 VEGF、MMP-2、MMP-9 的含量 把抽取的腹水離心取上清液，用Elisa試劑盒檢測(cè)腹水中的VEGF、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，酶標(biāo)儀檢測(cè)各自的吸光度值，最后算出VEGF、MMP-2、MMP-9的含量。

2.5 數(shù)據(jù)分析 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)數(shù)資料以χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠生活狀態(tài)觀察及體重腹圍變化情況 模型對(duì)照組小鼠在第5天體重、腹圍開(kāi)始增長(zhǎng)，在8～9天開(kāi)始迅速增長(zhǎng)，晚期表現(xiàn)為進(jìn)食量減少、消瘦，腹部隆起，活動(dòng)受限，倦怠懶動(dòng)，毛發(fā)易脫落，精神狀態(tài)差;替加氟組和人參二苓湯有效部位高劑量組體重、腹圍緩慢增長(zhǎng)，進(jìn)食稍減;人參二苓湯有效部位中劑量組后期體重和腹圍較快增長(zhǎng);人參二苓湯有效部位低、中、高各劑量組小鼠精神狀態(tài)好。各組小鼠治療前后體重及腹圍的變化情況見(jiàn)表1。治療后替加氟組和人參二苓湯有效部位各劑量組小鼠體重、腹圍均低于模型組，其中替加氟組和人參二苓湯有效部位高劑量組有顯著性差異(P＜0.01)，人參二苓湯有效部位中劑量組有差異(P＜0.05)，而人參二苓湯有效部位低劑量組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表1 各組小鼠治療前后體重、腹圍變化(±s，n=12)

表1 各組小鼠治療前后體重、腹圍變化(±s，n=12)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

體重(g)腹圍(cm)組別 劑量(g/kg)83替加氟組 0.12 20.29±1.86 38.99±3.56＊＊ 6.01±0.17 8.58±0.51＊＊低劑量組 6.10 20.21±1.75 41.97±5.02 6.03±0.18 10.31±0.97中劑量組 9.90 20.63±1.61 39.56±3.64* 6.11±0.21 9.39±0.72*高劑量組 13.20 20.55±1.89 37.83±4.67＊＊ 6.09±0.18 8.77±0.65治療前 治療后模型組 NS 20.31±1.59 43.62±2.63 6.08±0.19 10.89±0.治療前 治療后＊＊

表2 對(duì)H22荷瘤小鼠惡性腹水的腫瘤抑制率(±s，n=12)

表2 對(duì)H22荷瘤小鼠惡性腹水的腫瘤抑制率(±s，n=12)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量(g/kg)腹膜瘤結(jié)節(jié)數(shù)平均瘤重(g)抑瘤率(%)NS 140 1.07±0.13 /替加氟組 0.12 99＊＊ 0.52±0.27＊＊ 51.40低劑量組 6.10 136 0.91±0.17 14.95中劑量組 9.90 128* 0.83±0.23 22.42高劑量組 13.20 120* 0.69±0.21*模型組35.51

3.2 人參二苓湯有效部位對(duì)H22荷瘤小鼠惡性腹水的腫瘤抑制率 表2結(jié)果顯示:與模型組比較，替加氟組小鼠腹膜瘤結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少，有顯著性差異(P＜0.01);人參二苓湯有效部位中、高劑量組小鼠腹膜瘤結(jié)節(jié)數(shù)減少，存在差異(P＜0.05);而人參二苓湯有效部位低劑量組小鼠腹膜瘤結(jié)節(jié)數(shù)無(wú)明顯變化(P＞0.05)，因此人參二苓湯有效部位高劑量組和替加氟組對(duì)H22荷瘤小鼠惡性腹水的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用。

3.3 H22荷瘤小鼠惡性腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9的含量 由表3可知，與模型組比較，人參二苓湯有效部位高劑量組小鼠腹水中VEGF的含量有顯著性差異(P＜0.01)，MMP-2和MMP-9的含量有差異(P＜0.05);人參二苓湯有效部位中劑量組小鼠腹水中VEGF的含量有差異(P＜0.05)，MMP-2和MMP-9的含量無(wú)差異(P＞0.05);人參二苓湯有效部位低劑量組小鼠腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9的含量均無(wú)差異(P＞0.05)。這說(shuō)明人參二苓湯有效部位可抑制小鼠腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9的表達(dá)。

表3 小鼠腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9含量比較(±s，n=12)

表3 小鼠腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9含量比較(±s，n=12)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量(g/kg)VEGF(ng/mL)MMP-2(ng/mL)MMP-9(ng/mL)NS 1389.1±53.20 36.25±4.58 1.67±0.43替加氟組 0.12 987.2±36.28＊＊ 19.26±3.23＊＊ 0.52±0.17＊＊低劑量組 6.10 1293.2±37.85 30.19±4.17 1.31±0.19中劑量組 9.90 1051.5±55.23* 27.83±3.25 1.03±0.33高劑量組 13.20 1005.3±36.78＊＊ 21.69±2.24* 0.89±0.28模型組*

4 討論

人參二苓湯由人參、茯苓、豬苓、白術(shù)、防風(fēng)、蟬蛻組成。本方中君藥為人參，具有大補(bǔ)元?dú)?，健脾養(yǎng)胃之功。用于本實(shí)驗(yàn)研究符合惡性腫瘤腹水患者久病體虛、正氣不足的病機(jī)特點(diǎn)，正氣充則邪不可干，脾胃健則濕邪自去。臣藥有茯苓、豬苓，能夠滲泄水濕，其中茯苓又能健脾益氣，輔助人參增強(qiáng)健脾益氣之功效。佐藥用白術(shù)、澤瀉，協(xié)助人參、茯苓增強(qiáng)溫中健脾之效，同時(shí)加強(qiáng)二苓利水祛邪之功。方中蟬蛻有疏散風(fēng)熱、宣散透發(fā)之功效，蟬蛻亦有利水之功效，能防止方中參、術(shù)之溫性太過(guò)，反致化熱助邪。此方用藥法度嚴(yán)明，緊扣惡性腹水患者脾虛濕盛的病機(jī)，故能隨證取效。目前對(duì)人參二苓湯所涉單藥在治療腫瘤中的作用研究較多。如:現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為人參皂苷和人參多糖不僅能增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，而且可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為茯苓富含茯苓多糖，豬苓富含麥角甾醇多糖，可促進(jìn)免疫抗腫瘤，其中羧甲基茯苓多糖可下調(diào)bcl-2基因(B細(xì)胞淋巴瘤中鑒定出來(lái)的癌基因)的mRNA和蛋白的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［10］。

目前研究認(rèn)為，惡性腹水形成的機(jī)制之一是腫瘤侵襲腹膜和腸壁，使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，增加血管通透性，血液中大分子物質(zhì)滲出［4］。血管的發(fā)生過(guò)程對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起著重要作用，而VEGF是腫瘤中血管生成的關(guān)鍵刺激因子。由于腫瘤組織內(nèi)、外都可以大量分泌VEGF，可以通過(guò)對(duì)VEGF的阻滯，減少惡性腹水的形成，因此對(duì)VEGF活性的抑制是治療惡性腹水的重要靶點(diǎn)之一。Xu等［11］研究表明，口服VEGF受體抑制劑PTK787 50mg/kg可抑制VEGF活性，降低血管通透性，進(jìn)而抑制惡性腹水的形成。MMPs是一組鋅離子依賴的蛋白水解酶家族，參與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解。研究表明，MMP-2和MMP-9屬于MMPs家族成員中降解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的重要蛋白酶，在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起重要作用，能促進(jìn)血管生成，提高血管通透性，與惡性腹水的發(fā)生密切相關(guān)［12，13］。

本研究利用H22荷瘤小鼠惡性腹水模型，探討人參二苓湯有效部位灌胃給藥對(duì)惡性腹水的療效。采用人參二苓湯有效部位低、中、高劑量組，連續(xù)灌胃給藥14天，結(jié)果顯示，人參二苓湯有效部位對(duì)H22荷瘤小鼠惡性腹水形成有顯著的抑制作用，并且能提高生活質(zhì)量。本研究還表明，人參二苓湯有效部位灌胃給藥可降低H22荷瘤小鼠惡性腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9的含量，為臨床使用中醫(yī)藥治療惡性腹水提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Becker G.Medical and palliative management of malignant ascites［J］.Cancer Treat Res，2007(134):459-467.

［2］Rosenberg SM.Palliation of malignant ascites［J］.Gastroenterol Clin North Am，2006，35(1):189-199.

［3］Becker G，Galandi D，Blum HE.Malignant ascites:systematic review and guideline for treatment［J］.Eur J Cancer，2006，42(5):589-597.

［4］張志紅.惡性腹水的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)腫瘤臨床與康復(fù)，2008，15(4):182-183.

［5］金燕，柏愚，李兆申.惡性腹水的診治［J］.胃腸病學(xué)，2008，13(11):699-700.

［6］張欣，賈英杰.惡性腹水的臨床治療進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2008，17(4):536-537.

［7］金莉，傅華洲.人參二苓湯防治胃癌化療后不良反應(yīng)及其對(duì)免疫功能的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30(5):1 182-1 184.

［8］傅大治.人參二苓湯聯(lián)合厄洛替尼治療晚期非小細(xì)胞肺癌臨床觀察［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31(2):442-443.

［9］傅大治.人參二苓湯聯(lián)合培美曲塞、卡鉑治療晚期非小細(xì)胞肺癌46例臨床觀察［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36(9):998-1 000.

［10］李永強(qiáng)，潘琦津，劉志輝，等.利用荷H22腹水瘤小鼠惡性腹水模型比較培美曲塞腹腔用藥與靜脈用藥的療效［J］.世界華人消化雜志，2012(36):3 767-3 772.

［11］蔚林蘭，馮明輝，杜發(fā)斌，等。水律湯對(duì)H22肝癌腹水小鼠生存期及體重的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2010，20(2):100-125.

［12］徐瑞榮，王曉玲，王敬毅，等.中藥復(fù)方對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病干細(xì)胞FIT3和N-ras基因表達(dá)影響［J］.中國(guó)組織工程研究和臨床康復(fù)，2009，13(40):7 969-7 973.

［13］Xu L，Yoneda J，Herrera C，et al.Inhibition of malignant ascites and growth of human ovarian carcinoma by oraladministration of a potent inhibitor of the vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases［J］.Int J Oncol，2000，16(3):445-454.

［14］呂東來(lái)，魏品康，秦志豐.惡性腹水的中西醫(yī)治療現(xiàn)狀與新進(jìn)展［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2008，16(2):137-139.

［15］鐘崇，蘇小康，韋瑋，等.肝癌患者血清及腫瘤組織 MMP-2/9的表達(dá)及意義［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2010，17(10):4-5.