李佳縈， 馮 烈

傳統(tǒng)的降糖藥物無法阻止胰島β細(xì)胞的進(jìn)行性衰竭。干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展有望解決這一難題。體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化為胰島素分泌細(xì)胞是目前的研究熱點。大量動物實驗利用不同的培養(yǎng)方法充分證明了此種定向分化的可行性。然而，這些方法一般所需的周期較長，有的甚至達(dá)數(shù)月之久。本研究旨在嘗試一種新的培養(yǎng)方法，有望在10 d內(nèi)成功誘導(dǎo)BMSCs定向分化，并且探討這種新型誘導(dǎo)劑——曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)的適宜濃度，希望為此領(lǐng)域的研究提供一個方便快捷、值得推廣的方法。

材料和方法

1 細(xì)胞和試劑

C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司，干細(xì)胞完全培養(yǎng)基購自Gibco，曲古抑菌素A和雙硫腙購自Sigma，胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)購自杭州中肽生化有限公司，細(xì)胞級二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自 Sigma，DMEM/F12 培養(yǎng)基購自M＆C，兔抗人胰島素抗體購自Santa Cruz，山羊抗兔Ⅱ抗購自Invitrogene，胰島素ELISA試劑盒購自廣州外顯子生物科技有限公司。

2 實驗分組

實驗分為5組:對照組(DMSO，A組)和干預(yù)組(25 nmol/L，B組;50 nmol/L，C組;100 nmol/L，D組;200 nmol/L，E 組)。

3 方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系培養(yǎng)于C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中(低糖DMEM，含10%胎牛血清、10 mmol/L HEPES、1×105U/L青霉素和100 mg/L的鏈霉素)，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長良好的細(xì)胞鋪進(jìn)25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，80% ～90%時進(jìn)行傳代，分別用無酚紅、無血清的DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理，即37℃、5%CO2中培養(yǎng)6 h，使其處于同步化狀態(tài)，根據(jù)實驗要求稀釋3×105細(xì)胞懸液加入鋪有玻片的6孔板中培養(yǎng)，每24 h換液1次，共3 d。然后進(jìn)行實驗分組，加入TSA進(jìn)行誘導(dǎo)處理，3 d后洗脫TSA，加入含GLP-1的高糖培養(yǎng)基7 d后檢測各項指標(biāo)。

3.2 雙硫腙染色鑒定胰島素分泌細(xì)胞 加入含GLP-1的高糖培養(yǎng)基7 d后進(jìn)行雙硫腙染色，50 mg雙硫腙溶解在5 mL DMSO中，磁場攪拌30 min，0.2 μm過濾器過濾分裝，-20℃避光保存。使用時將10 μL雙硫腙冷溶液加入1 mL GLP-1培養(yǎng)液中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)30 min，PBS洗3遍，倒置相差顯微鏡下觀察胰島樣細(xì)胞。每張片選取5個視野，使用上海捷達(dá)圖像分析系統(tǒng)，根據(jù)免疫組化的結(jié)果計算胰島素染色陽性面積、陽性率(胰島素染色陽性面積/細(xì)胞總面積)，代表胰島素分泌細(xì)胞的量，計算胰島素染色積分吸光度(平均吸光度×胰島素染色陽性面積)代表胰島素表達(dá)總量。

3.3 免疫熒光染色鑒定胰島素分泌表達(dá) 待檢細(xì)胞首先用未標(biāo)記的兔抗人胰島素抗體(Ⅰ抗)處理，使之與特異的抗原(胰島素)形成復(fù)合物，然后再用熒光藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的山羊抗兔抗體(Ⅱ抗)著色，即可檢測出胰島素在細(xì)胞中的存在部位，以 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)作為對比劑。熒光顯微鏡下觀察。以488 nm波長的激發(fā)光激發(fā)，對各樣本進(jìn)行掃描。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對獲得的圖像進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，取其平均熒光值作為定量參數(shù)。

3.4 ELISA測定胰島素含量 采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定樣品中小鼠胰島素的水平。向預(yù)先包被了小鼠胰島素單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入胰島素，溫育;溫育后加入生物素標(biāo)記的抗胰島素抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色的深淺與樣品中小鼠胰島素的濃度成正比。以空白調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的A值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計算出對應(yīng)樣品的胰島素含量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，不符合正態(tài)分布者經(jīng)自然對數(shù)校正后進(jìn)行分析，計量資料的多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞形態(tài)觀察

生長良好的C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)，各個實驗組間細(xì)胞形態(tài)上無明顯差異，呈典型的長梭形樣外觀，極性排列，細(xì)胞輪廓清楚，見圖1。經(jīng)過TSA干預(yù)3 d后，光鏡下可見，各個實驗組間細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)上有明顯差異。干預(yù)組中，隨著TSA濃度的增加，細(xì)胞的極性生長越來越明顯，死亡細(xì)胞的數(shù)目越來越多，而對照組中細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目無明顯變化，見圖2。

Figure 1.Morphology of C57BL/6 mouse mesenchymal stem cells under optical microscope.圖1 C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)

Figure 2.Morphology of the cells treated with TSA for 3 d(×100).圖2 TSA干預(yù)3 d后各組細(xì)胞形態(tài)

2 雙硫腙染色鑒定胰島素分泌細(xì)胞

加入含GLP-1的高糖培養(yǎng)基7 d后進(jìn)行雙硫腙染色。光鏡下可見各干預(yù)組形成胰島樣細(xì)胞，胞漿可見棕黃色囊泡樣結(jié)構(gòu)，且隨著TSA濃度的增加，胞漿內(nèi)棕黃色囊泡樣著色逐漸減弱，呈負(fù)相關(guān);對照組未見胞漿棕黃色囊泡樣結(jié)構(gòu)，見圖3。免疫組化半定量分析顯示，B組胰島素染色陽性面積、陽性率以及胰島素染色積分吸光度顯著高于其它干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

3 免疫熒光染色鑒定胰島素分泌

熒光顯微鏡觀察顯示，細(xì)胞呈長梭形極性排列，細(xì)胞核呈藍(lán)色。各干預(yù)組均見紅色顆粒狀物質(zhì)散在均勻分布于胞漿中以及細(xì)胞外，且隨著TSA濃度的增加，紅色熒光逐漸減弱，呈負(fù)相關(guān);對照組未見紅色顆粒狀物質(zhì)，見圖4。免疫熒光圖像分析顯示，B組平均熒光強(qiáng)度顯著高于其它干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

4 ELISA測定胰島素含量

各組細(xì)胞在相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，1 500 r/min離心10 min，收集上清，ELISA測定各組胰島素的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著TSA干預(yù)濃度的增加，胰島素的含量逐漸減少。B組胰島素含量顯著高于其它組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

Figure 3.The insulin-secreting cells in each group identified by dithizone staining.圖3 雙硫腙染色鑒定胰島素分泌細(xì)胞

Figure 4.Insulin secretion of insulin-producing cells detected by immunofluorescent staining(×200).圖4 免疫熒光染色鑒定胰島素分泌細(xì)胞的胰島素分泌

表1 各組免疫組化及免疫熒光半定量分析Table 1.Immunohistochemical and immunofluorescence semi-quantitative analysis in different groups(Mean±SD.n=5)

表2 各組胰島素含量的比較Table 2.Comparison of insulin contents in each group(Mean±SD.n=5)

討 論

糖尿病已經(jīng)成為一個新的流行性疾病。據(jù)最新的調(diào)查研究顯示，目前我國成人糖尿病患者約有1.14億［1］。傳統(tǒng)的藥物治療都不能阻止胰島β細(xì)胞的進(jìn)行性衰竭。干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的研究可能為臨床胰島細(xì)胞移植提供充足的供體細(xì)胞，揭開了糖尿病治療全新的一頁。與胚胎干細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞特別是BMSCs，具有取材方便、無免疫干擾以及避免法律和倫理學(xué)的限制等優(yōu)點，許多針對動物模型的研究表明，將BMSCs誘導(dǎo)分化成為胰島素分泌細(xì)胞，可以用來治療糖尿病［2-5］。體外BMSCs誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法有很多，然而這些方法一般所需的周期較長，有的甚至達(dá)數(shù)月之久。因此，本領(lǐng)域需要一種簡單、快速的方法，能夠方便有效地將BMSCs誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞。

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)決定組蛋白乙?；癄顟B(tài)，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。HAT和HDAC的異常與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。近年來大量研究表明，組蛋白脫乙酰酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACI)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，并可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，是新一代具有廣泛應(yīng)用前景的抗腫瘤藥［6-7］。TSA源自鏈霉菌代謝產(chǎn)物，最先作為抗真菌藥物使用［8］。近來研究表明其具有明顯的組蛋白去乙?；敢种苿┗钚?，對肝癌、胃癌、口腔癌及人神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用［9］。而且，隨著對胰腺的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TSA能夠阻止細(xì)胞因子誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡以及核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)下調(diào)后 β細(xì)胞功能的受損［10］。而且能夠劑量依賴性地顯著增強(qiáng)C2C12骨骼肌細(xì)胞胰島素刺激的血糖攝取和糖原合成，以及絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，AKT)和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在HDAC2下調(diào)后，這種效應(yīng)仍然存在，表明HDAC2可能是調(diào)節(jié)胰島素敏感性的潛在靶點［11］。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，胰島素受體底物1的乙?；軌蛟鰪?qiáng)酪氨酸磷酸化以及促進(jìn)胰島素刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［12］。Tayaramma 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，55 nmol/L TSA能夠促進(jìn)小鼠BMSCs分化為胰島樣細(xì)胞。目前已經(jīng)證實胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓來源［14］，表明骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與胰腺的發(fā)生發(fā)育之間存在緊密聯(lián)系。因此，本實驗選取BMSCs作為研究對象，并在Tayaramma等研究基礎(chǔ)上，選取 25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L 和 200 nmol/L 4個梯度濃度作為實驗濃度，驗證Tayaramma等研究結(jié)果，探討TSA這種HDACI在誘導(dǎo)干細(xì)胞分化方面的作用，并且嘗試尋找此種新型誘導(dǎo)劑應(yīng)用于該領(lǐng)域的適宜濃度。由于TSA原始包裝是溶于DMSO中，因此本實驗選取單純DMSO與細(xì)胞共培養(yǎng)作為對照組。實驗結(jié)果顯示，25 nmol/L TSA即可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠BMSCs分化成為胰島素分泌細(xì)胞，并且分泌胰島素;隨著各干預(yù)組TSA濃度的升高，胰島素的分泌量減少。大量研究表明，TSA具有明顯的細(xì)胞毒作用，能夠激活腫瘤細(xì)胞的凋亡通路［15］以及增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫應(yīng)答［16］。Nakajima等［17］研究發(fā)現(xiàn)，500 nmol/L時 TSA能夠自身誘導(dǎo)低水平的腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，與 Tayaramma等［13］報道結(jié)果相比較，我們認(rèn)為25 nmol/L TSA可有效誘導(dǎo)C57BL/6小鼠BMSCs分化成為胰島素分泌細(xì)胞，且細(xì)胞毒性小，是采用TSA進(jìn)行干預(yù)的適宜濃度。

綜上所述，針對目前存在眾多誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，且這些方法一般所需的周期較長，本研究在國內(nèi)首次利用一種新型的誘導(dǎo)劑TSA，能夠成功在10 d內(nèi)將小鼠BMSCs誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞，并且進(jìn)一步探討TSA的適宜濃度為25 nmol/L。

［1］ Xu Y，Wang L，He J，et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults［J］.JAMA，2013，310(9):948-959.

［2］ Ye X，Yan T，Chopp M，et al.Combination BMSC and Niaspan treatment of stroke enhances white matter remodeling and synaptic protein expression in diabetic rats［J］.Int J Mol Sci，2013，14(11):22221-22232.

［3］ Ansari MM，Sreekumar TR，Chandra V，et al.Therapeutic potential of canine bone marrow derived mesenchymal stem cells and its conditioned media in diabetic rat wound healing［J］.J Stem Cell Res Ther，2013，3:141.

［4］ Zhao YF，Zeng DL，Xia LG，et al.Osteogenic potential of bone marrow stromal cells derived from streptozotocininduced diabetic rats［J］.Int J Mol Med，2013，31(3):614-620.

［5］ Beck Jr GR，Khazai NB，Bouloux GF，et al.The effects of thiazolidinediones on human bone marrow stromal cell differentiation in vitro and in thiazolidinedione-treated patients with type 2 diabetes［J］.Transl Res，2013，161(3):145-155.

［6］ Paterson S，Sin KL，Tiang JM，et al.Histone deacetylase inhibitors increase human arylamine N-acetyltransferase-1 expression in human tumor cells［J］.Drug Metab Dispos，2011，39(1):77-82.

［7］ Konsoula Z，Velena A，Lee R，et al.Histone deacetylase inhibitor:antineoplastic agent and radiation modulator［J］.Adv Exp Med Biol，2012，720:171-179.

［8］ 馬 爽，翟志勇，郭 陽.曲古霉素A促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系凋亡［J］.解剖科學(xué)進(jìn)展，2013，19(3):282-285，289.

［9］ Gothalwal R，Gupta P.Pharma-active compounds of microbial origin and their diversity［M］∥ Maheshwari DK，Dubey RC，Saravanamurthu R.Industrial exploitation of microorganisms.1st ed.New Delhi:I.K.International Publshing House，2010:375.

［10］Sato T，Kotake D，Hiratsuka M，et al.Enhancement of inflammatory protein expression and nuclear factor κB(NF-κB)activity by trichostatin A(TSA)in OP9 preadipocytes［J］.PLoS One，2013，8(3):e59702.

［11］Pirola L，Zerzaihi O，Vidal H，et al.Protein acetylation mechanisms in the regulation of insulin and insulin-like growth factor 1 signalling［J］.Mol Cell Endocrinol，2012，362(1-2):1-10.

［12］ Sun C，Zhou J.Trichostatin A improves insulin stimulated glucose utilization and insulin signaling transduction through the repression of HDAC2［J］.Biochem Pharmacol，2008，76(1):120-127.

［13］ Tayaramma T，Bin M，Manfred R，et al.Chromatin-remodeling factors allow differentiation of bone marrow cells into insulin-producing cells［J］.Stem Cells，2006，24(12):2858-2867.

［14］Sordi V，Melzi R，Mercalli A，et al.Mesenchymal cells appearing in pancreatic tissue culture are bone marrow-derived stem cells with the capacity to improve transplanted islet function［J］.Stem Cells，2010，28(1):140-151.

［15］Hong Z，Han Z，Xiao M，et al.Microarray study of mechanism of trichostatin a inducing apoptosis of Molt-4 cells［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2009，29(4):445-450.

［16］ DuPage M，Jacks T.Genetically engineered mouse models of cancer reveal new insights about the antitumor immune response［J］.Curr Opin Immunol，2013，25(2):192-199.

［17］ Nakajima S，Niizeki H，Tada M，et al.Trichostatin A with adenovirus-mediated p53 gene transfer synergistically induces apoptosis in breast cancer cell line MDA-MB-231［J］.Oncol Rep，2009，22(1):143-148.