郭 英，高云濤

(1.鄖陽師范高等?？茖W(xué)校化生系，湖北十堰442000;2.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650500)

玫瑰花是薔薇科薔薇屬多年生常綠或落葉性灌木［1］，作為一種節(jié)日主要切花，在全國各地均有種植［2］。玫瑰花是一種食藥皆宜的花卉，能理氣散淤、和血養(yǎng)血和鎮(zhèn)靜安神，具有治療心悸氣短和陰虛體弱的功效［3］。除此之外，玫瑰花是玫瑰精油的提取原料。水蒸氣蒸餾提取玫瑰精油過程中會產(chǎn)生大量的玫瑰花渣，其含有一定量的黃酮類化合物等有效成分［4］。但目前玫瑰花渣多作為廢棄物扔掉，不僅浪費(fèi)資源，而且污染環(huán)境。

黃酮類化合物可防治心腦血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗輻射、抗癌、抗腫瘤等多種藥理活性［5］。目前，黃酮類化合物的提取方法為有機(jī)溶劑提取、熱水提取、堿提法、微波提取法、超聲波提取法［6］等。超聲波提取利用了超聲波的空化效應(yīng)使黃酮類化合物溶出，具有省時(shí)、高效、節(jié)能的特點(diǎn)［7］。雙水相萃取［8］是基于液－液萃取原理，同時(shí)考慮到保持生物活性所開發(fā)的一種新型萃取分離技術(shù)，具有分相時(shí)間短、易于連續(xù)操作、目標(biāo)產(chǎn)物分配系數(shù)大、投資費(fèi)用少等特點(diǎn)，是一種較為經(jīng)濟(jì)、簡單、靈敏度高和應(yīng)用范圍廣的分離手段。高云濤等提出超聲－雙水相耦合提取新方法［9］，方法融合了超聲的高效提取及雙水相分離的優(yōu)勢，提取率和產(chǎn)物純度高。在此基礎(chǔ)上，本文將超聲－雙水相耦合提取方法應(yīng)用于玫瑰花渣中黃酮的提取，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

玫瑰花渣(昆明酷特利生物科技有限公司)，提取前用真空干燥，并粉碎機(jī)粉碎至80目(0.18mm)以下。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(購于sigma公司)，5%NaNO2溶液，10%Al(NO3)3溶液，4%NaOH溶液，(NH4)2SO4，正丙醇，無水乙醇，石油醚，所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.1.2 儀器

AS3120A超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);7200型紫外可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);電子天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 濁點(diǎn)滴定(雙水相的形成)

準(zhǔn)確稱取100 g(NH4)2SO4，溶于水，于250 mL容量瓶中配成40%的(NH4)2SO4水溶液。分別取一定體積，稀釋，得到4% ～40%的(NH4)2SO4水溶液。取5 mL于25 mL比色管中，用正丙醇進(jìn)行滴定。滴定過程中，每隔幾秒搖動比色管，使(NH4)2SO4水溶液與正丙醇混合均勻，并仔細(xì)觀察，直至比色管出現(xiàn)渾濁。靜置，使其穩(wěn)定分相。記錄滴定管讀數(shù)。繼續(xù)用蒸餾水滴定至混合液又由渾濁變澄清，記下讀數(shù)。如此反復(fù)滴定，根據(jù)濁點(diǎn)時(shí)消耗的正丙醇體積和變澄清時(shí)消耗的水的體積，計(jì)算各組分的含量。此情況下形成的是鹽溶液占優(yōu)勢的雙水相體系。另外，取不同體積分?jǐn)?shù)(20% ～90%)的正丙醇水溶液，用40%的(NH4)2SO4水溶液進(jìn)行滴定，方法同上。最后，以正丙醇體積分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，繪制正丙醇—(NH4)2SO4雙水相體系形成過程中的濁點(diǎn)曲線圖。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作［9］

精確稱取經(jīng)105℃干燥恒重的蘆丁對照品20 mg，置l00 mL量瓶中。加80%乙醇溶解至刻度，搖勻即得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液。精密吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 、5.0、6.0、7.0、8.0 mL對照品溶液分別置于25 mL比色管中，各加30%乙醇定容至10 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻放置6 min;再加10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，再放置6 min;加4%NaOH溶液10 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻放置15 min。以蒸餾水作參比，用1 cm比色皿于波長510 nm處測其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

用最小二乘法進(jìn)行回歸，得到吸光度和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度的回歸方程:y=12.546x+0.0058，R2=0.9998。這表明該方法在0.008～0.064 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，可用于玫瑰花渣提取物中總黃酮含量的測定。

1.2.3 玫瑰花渣總黃酮的提取

用植物粉碎機(jī)將玫瑰花渣碎至約0.180 mm(80目)。準(zhǔn)確稱取1.00 g于100 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL正丙醇－(NH4)2SO4雙水相體系溶液，靜置1 h，超聲30 min后，抽濾。將濾液轉(zhuǎn)入60 mL分液漏斗中，靜置，待完全分相后，取上層清液，量體積。加入同體積的蒸餾水，0.2倍體積的石油醚，搖勻，靜置。待完全分相后，取下相清液，用30% 乙醇定容，作為待測液。

1.2.4 玫瑰花渣總黃酮的測定

按前述 NaNO2－A1(NO3)3比色法［10］，按照1.2.2的方法對樣品溶液中總黃酮含量進(jìn)行測定，得到不同條件下的吸光度值。利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算，從而得到提取液中的總黃酮含量:總黃酮得率 =(提取液中總黃酮質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 濁點(diǎn)滴定曲線

按照1.2.2的實(shí)驗(yàn)方法制作正丙醇—(NH4)2SO4雙水相體系的濁點(diǎn)滴定圖，結(jié)果如圖1。

圖1 濁點(diǎn)滴定曲線Fig.1 The titration curve of turbid point

由圖1可看出，加入正丙醇量越大，恰好分相時(shí)，所需(NH4)2SO4的量就越小;反之，體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，恰好分相時(shí)所需的正丙醇體積分?jǐn)?shù)就越低。同時(shí)從該圖也看出，當(dāng)正丙醇為某一定值時(shí)，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)也必須高于上圖所對應(yīng)的最低值才能保證分相。如，在正丙醇體積分?jǐn)?shù)為34.78%時(shí)，(NH4)2SO4在整個(gè)體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)必須達(dá)到5.22%以上，否則無法形成雙水相。即當(dāng)成相物的濃度在該曲線以下時(shí)，將不能形成雙水相體系。

2.2 最佳提取工藝的確定

影響超聲提取的因素很多，如溶劑種類、超聲時(shí)間、超聲功率、溫度、溶劑用量、提取次數(shù)以及提取時(shí)間等。本文重點(diǎn)研究了正丙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、(NH4)2SO4用量、料液比4個(gè)因素對玫瑰花提取物中總黃酮得率的影響。通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選出對總黃酮得率影響顯著的因素，并確定出各因素的最佳水平范圍。

2.2.1 (NH4)2SO4用量對提取效果的影響

在正丙醇體積分?jǐn)?shù)保持60%的情況下，分別向 10 mL 水溶液中加入 0.65、0.8、1.2、1.6、1.4、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4 g(NH4)2SO4固體。使其充分溶解后，加入15 mL正丙醇，振蕩使形成穩(wěn)定雙水相。此時(shí)，在雙水相體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.6%、3.2%、4.8%、6.4%、8%、9.6%、11.2%、12.8%、14.4%、16%。分別加入玫瑰花渣粉末各1 g，按照1.2.3的提取方法進(jìn)行提取，得到(NH4)2SO4用量對提取效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 (NH4)2SO4用量對提取效果的影響Fig.2 The effects of ammonium(w%)amount on extraction

由圖2可看出，隨著(NH4)2SO4用量的升高，吸光度逐漸增大，而當(dāng)體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到12.8%后，吸光度開始下降，這是因?yàn)?NH4)2SO4量大會帶走更多的水，使有機(jī)相中的水量減少，而有些黃酮類物質(zhì)是水溶性的，故而使有機(jī)相中的黃酮含量減少，綜合各種因素，(NH4)2SO4用量以體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%為宜。

2.2.2 超聲時(shí)間對提取效果的影響

用一定濃度的(NH4)2SO4溶液與正丙醇混合制成雙水相，浸泡樣品，并正使丙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。按照1.2.3的提取方法進(jìn)行提取，考察超聲時(shí)間對提取效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的增大，吸光度先升高后降低，根據(jù)圖中顯示選30 min作為最佳超聲提取時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間對提取效果的影響Fig.3 The effects of ultrasonic time on extraction

2.2.3 正丙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響

用一定濃度的(NH4)2SO4溶液與不同體積的正丙醇混合制成雙水相，浸泡樣品，并使正丙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%。體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，超聲時(shí)間為30 min，按照1.2.3的提取方法進(jìn)行提取，得到正丙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響曲線，見圖4。由圖4可看出，選用50%的正丙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行雙水相提取最佳。

圖4 丙醇濃度對提取效果的影響Fig.4 The effects of volume fraction of propanol on extraction

2.2.4 料液比對提取效果的影響

用一定濃度的(NH4)2SO4溶液與正丙醇混合制成雙水相，浸泡樣品，并使丙醇濃度體積分?jǐn)?shù)為50%，體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，超聲時(shí)間為 30 min，分別用 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 的料液比(g/mL)按照 1.2.3的提取方法進(jìn)行提取，得到料液比對提取效果的影響曲線，見圖5。

圖5 料液比對提取效果的影響Fig.5 The effects of ratio of solid to solution on extraction

由圖5可知，隨著料液比的增大，吸光度逐漸增大，但是考慮到料液比過大，會增加成本，所以選用1∶40的料液比進(jìn)行雙水相提取，即1 g樣品對應(yīng)40 mL的提取溶劑。

2.2.5 玫瑰花渣提取物總黃酮雙水相提取工藝的確定

按上述單因素實(shí)驗(yàn)得出最佳提取工藝條件為:體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%、正丙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比(g/mL)為1∶40、超聲提取時(shí)間為30 min。按照該工藝對玫瑰花渣中總黃酮物質(zhì)進(jìn)行超聲耦合正丙醇－(NH4)2SO4雙水相提取，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，得到總黃酮的平均得率為3.42%。

3 結(jié)論

1)將超聲波技術(shù)和雙水相萃取技術(shù)耦合用于提取玫瑰花渣中總黃酮。通過單因素實(shí)驗(yàn)得出最佳提取工藝條件為:體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 12%、正丙醇體積分?jǐn)?shù)為 50%、料液比為1∶40(g/mL)、超聲提取時(shí)間為30 min。在此工藝條件下，得到總黃酮平均得率為3.42%。

2)本文的研究表明，超聲波與丙醇－(NH4)2SO4雙水相體系可方便實(shí)現(xiàn)耦合集成，并縮短提取時(shí)間、提高得率，降低提取溫度，有利于熱敏成分的分離，獲得高純度高活性的黃酮類物質(zhì)，在生物活性成分的提取分離［11］領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。

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