張 樞，韓江彬，冷廣意，沙春潔，劉萬卉，

(1.煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東煙臺 264005;2.山東綠葉制藥有限公司長效和靶向制劑國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺 264003)

戈舍瑞林(goserelin)是人工合成的十肽，是促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)的類似物，臨床上主要適應(yīng)證之一是治療對激素依賴的前列腺癌［1］。其主要作用機(jī)制是作用于下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)，用藥初期作用于垂體GnRH受體，刺激垂體釋放卵泡刺激素和黃體生成素，從而導(dǎo)致性腺分泌睪酮增加，血中睪酮水平升高;長期用藥后可導(dǎo)致GnRH受體脫敏，使黃體生成素及垂體釋放卵泡刺激素的分泌減少，進(jìn)而降低血中睪酮濃度至去勢水平，抑制了前列腺癌細(xì)胞的生長，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用［2－3］。因此，戈舍瑞林需制成緩釋制劑，從而可以持續(xù)作用于受體，才能更好發(fā)揮藥效。本文通過大鼠sc給予戈舍瑞林緩釋植入劑，測定戈舍瑞林及其藥效學(xué)指標(biāo)睪酮在大鼠血漿中的濃度，探討戈舍瑞林緩釋植入劑在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)及藥效動力學(xué)行為特征。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

醋酸戈舍瑞林對照藥(肽純度86%)，購自瑞士Bachem AG公司，2～8℃冷藏保存;睪酮對照品(98.5%)，購自德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司;醋酸阿拉瑞林購自肽仕生物科技有限公司(上海);睪酮-d3和睪酮-13C3溶液購自美國Sigma公司;戈舍瑞林緩釋植入劑，實(shí)驗(yàn)室自制;色譜純甲醇購自美國Merck公司;乙酸、甲酸購自美國Fluka公司;Oasis?HLB小柱購自美國Waters公司;EP管，購自德國Eppendorf公司。

1.2 儀器及設(shè)備

QTRAP5500質(zhì)譜儀，美國 ABSciex公司;1290高效液相系統(tǒng)，配制二元泵，美國Agilent公司;MilliQ超純水制備儀，法國Molsheim公司;Fresco21冷凍離心機(jī)，英國Thermo Fisher公司。

1.3 動物

SD大鼠24只，雄性，體質(zhì)量240～260 g，由山東綠葉制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號:SCXK(魯)2009-0009。

1.4 給藥方法及血樣采集

將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分成3個實(shí)驗(yàn)組，分別采用每只0.3，0.6和1.2 mg 3個劑量，sc給藥。分別在給藥前(0 h)、給藥后0.5，1，6 h及1，2，3，4，9，11，13，15，18，21，28，35和42 d采血。血液置于預(yù)冷的肝素化的抗吸附EP管中，混勻后，4℃，10 000×g離心5 min，取上清液分裝至另兩個抗吸附EP管中，至－80℃保存待測。

1.5 高效液相色譜-質(zhì)譜測定條件

內(nèi)源性物質(zhì)睪酮的測定采用睪酮-d3為替代分析物［4－6］，以制備其標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控樣品。

色譜條件:戈舍瑞林和睪酮的色譜柱分別為ZORBAX Eclipse Plus C18柱和 ZORBAX Eclipse Plus C8柱(規(guī)格均為 Agilent，2.1 mm ×50 mm，1.8 μm，英國Stockport公司);戈舍瑞林流動相:B相為甲醇，A相為0.02%乙酸MilliQ水溶液;睪酮流動相:B相為甲醇，A相為甲酸銨1 mmol·L－1MilliQ水溶液(含0.1%甲酸);流速均為0.4 mL·min－1;柱溫分別為40℃和30℃;進(jìn)樣量均為10 μL。

質(zhì)譜條件:均采用電噴霧離子化源，正離子方式檢測，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測;戈舍瑞林源內(nèi)參數(shù)為:離子噴射電壓:5500 V;溫度:550℃;源內(nèi)氣體1(N2)壓力:40 psi;氣體 2(N2)壓力:50 psi.;氣簾氣體(N2)壓力:30 psi;碰撞氣:8 psi;睪酮源內(nèi)參數(shù)為:離子噴射電壓:5500 V;溫度:600℃;源內(nèi)氣體1(N2)壓力:45 psi;氣體2(N2)壓力:50 psi;氣簾氣體(N2)壓力:40 psi;碰撞氣:8 psi。戈舍瑞林和內(nèi)標(biāo)阿拉瑞林DP電壓為40 V;CE電壓為30 eV;睪酮，替代分析物睪酮-d3以及內(nèi)標(biāo)睪酮-13C3的DP電壓均為87 V;CE電壓均為26 eV;用于定量分析的離子反應(yīng)為:戈舍瑞林，635.4/607.3，內(nèi)標(biāo)阿拉瑞林，584.5/249.1，睪酮 289.3/97.0，睪酮-d3，292.2/97.0，睪酮-13C3，292.2/100.2。

1.6 樣品前處理?xiàng)l件

1.6.1 戈舍瑞林樣品前處理?xiàng)l件

取100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液(阿拉瑞林 10 μg·L－1)、50 μL大鼠血漿樣品、100 μL 甲醇-水(60∶40)于1.5 mL離心管中，加入 300 μL 甲醇，渦流混合1 min，離心10 min(10 000×g)，取上層所有溶液至另一含400 μL水的2 mL離心管中，混勻，加入已經(jīng)活化好的HLB固相萃取柱，以1 mL甲醇-水(60∶40，)洗雜質(zhì)，1 mL 甲醇洗脫，洗脫液置于50℃水浴，氮?dú)獯蹈伞?00 μL 甲醇-水(60∶40)復(fù)溶，渦流后取10 μL進(jìn)樣至液質(zhì)系統(tǒng)。

1.6.2 睪酮樣品前處理?xiàng)l件

取 100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液(睪酮-13C310 μg·L－1)、50 μL大鼠血漿樣品、100 μL 甲醇-水(60 ∶40)于10 mL離心管中，加入3 mL萃取液(正己烷∶二氯甲烷∶異丙醇2∶1∶0.1)，渦流混合 5 min，離心10 min(2800×g)，取上層所有溶液至另一離心管中置于 50℃ 水浴，氮?dú)獯蹈伞?00 μL 甲醇-水(60∶40)溶解，渦流后取10 μL進(jìn)樣至液質(zhì)系統(tǒng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Phoenix?WinNonlin?6.3軟件，以非房室模型法處理分析戈舍瑞林的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)。采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 高效液相色譜-質(zhì)譜方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 專屬性

取6只大鼠空白血漿，以稀釋液分別代替標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)，其余項(xiàng)按照1.6.1項(xiàng)處理，得色譜圖1-A;將一定濃度的戈舍瑞林標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)阿拉瑞林溶液加入空白血漿樣品，依樣品前處理項(xiàng)操作，得色譜圖1-B。按照1.6.1項(xiàng)處理給藥后樣品，得色譜圖1-C。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)，不干擾戈舍瑞林和內(nèi)標(biāo)阿拉瑞林的測定。色譜圖2結(jié)果表明，空白血漿中的其他內(nèi)源性物質(zhì)不干擾睪酮的測定。

Fig.1 Typical multiple reaction monitoring(MRM)chromatograms of goserelin(Ⅰ)and alarelin(Ⅱ)in rat plasma.A:blank rat plasma;B:rat plasma spiked with LLOQ solution and IS;C:rat plasma sample collected at 2 d following subcutaneous injection of goserelin implant with 0.6 mg per rat.

Fig.2 Typical MRM chromatograms of testosterone-d3(Ⅰ)，testosterone-13C3(Ⅱ)，testosterone(Ⅲ)in rat plasma.A:blank rat plasma;B:rat plasma spiked with LLOQ solution and IS;C:rat plasma sample collected at 2 d following subcutaneous injection of goserelin implant with 0.6 mg per rat.

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取空白血漿制成一定濃度的戈舍瑞林及睪酮-d3標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，戈舍瑞林:0.03，0.10，0.30，1.00，3.00，10.0 和 30.0 μg·L－1;睪酮-d3:0.05，0.10，0.30，1.0，3.0，10.0 和30.0 μg·L－1。以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得戈舍瑞林標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=0.221x+0.00114，r=0.9992，睪 酮-d3標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 為y=0.0452x+0.00353，r=0.9993。

2.1.3 精密度

分別制備戈舍瑞林0.05，1.00 和24.0 μg·L－1和睪酮-d30.10，1.00 和24.0 μg·L－1的質(zhì)量控制樣品，每濃度6樣本，連續(xù)測定3 d。戈舍瑞林日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.07%，1.05%和6.64%;日間相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為6.92%，3.44%和2.32%。睪酮-d3日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.76%，1.80%和4.38%;日間相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.00%，2.70%和2.13%。

2.1.4 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)

質(zhì)量控制樣品得到的色譜峰面積與空白基質(zhì)提取后添加相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣的色譜峰面積相比，計(jì)算3個濃度(每濃度4樣品)質(zhì)量控制樣品的提取回收率。戈舍瑞林的提取回收率分別為66.9%，65.4%和 67.4%，睪酮-d3的提取回收率分別為97.5%，96.9%和99.1%。空白基質(zhì)提取后添加相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣的色譜峰面積與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積相比，計(jì)算3個濃度(每濃度4樣品)質(zhì)量控制樣品的基質(zhì)效應(yīng)。戈舍瑞林的基質(zhì)效應(yīng)分別為99.0%，100.2%和98.3%，睪酮-d3的基質(zhì)效應(yīng)分別為 102.5%，100.7%和 99.9%。

2.1.5 穩(wěn)定性

戈舍瑞林和睪酮的大鼠血漿樣品經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)，室溫放置3 h，在－80℃下放置60 d以及樣品經(jīng)處理后室溫放置10 h后的穩(wěn)定性。所有樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差絕對值均小于15%，表明大鼠血漿樣品中戈舍瑞林和睪酮在以上所有條件下均穩(wěn)定。

2.2 戈舍瑞林緩釋植入劑在大鼠的血藥濃度-時(shí)間曲線及其藥代動力學(xué)

大鼠皮下注射給予3個劑量戈舍瑞林緩釋植入劑后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。給藥初期，血藥濃度迅速上升，出現(xiàn)第一個峰值，其后緩慢釋放，在大約9～11 d達(dá)到第二個峰濃度。采用非房室模型進(jìn)行擬合獲取藥代學(xué)參數(shù)，計(jì)算結(jié)果見表1。采用線性回歸對3個劑量的AUC0－t和cmax進(jìn)行回歸分析，AUC0－t和 cmax線性回歸相關(guān)系數(shù)分別為r=0.942， P=0.000 ＜0.01， r=0.923，P=0.000＜0.01，結(jié)果表明線性回歸有意義。藥峰時(shí)間(Tmax)，半衰期(t1/2)，平均滯留時(shí)間(MRT)，清除率(Cl)與表觀分布容積(Vd)采用單因素方差分析顯示不同劑量組間均無顯著性差異。

Fig.3 Plasma concentration-time curves of goserelin in rats following subcutaneous injection of goserelin implant.±s，n=8.

2.4 戈舍瑞林緩釋植入劑在大鼠的藥效動力學(xué)

大鼠皮下注射給予3個劑量戈舍瑞林緩釋植入劑后，體內(nèi)睪酮濃度變化趨勢如圖4。各組睪酮濃度變化趨勢表現(xiàn)為:給藥初期顯著上升，4 d后降至低濃度水平，給藥后28～35 d恢復(fù)至正常水平。在每只0.3 mg水平下，大鼠給藥4 d后睪酮濃度下降至較低水平，但未完全達(dá)到理論去勢水平，給藥后21 d起，睪酮濃度即逐漸上升至正常水平。在每只0.6～1.2 mg水平下，大鼠給藥4 d后，睪酮濃度均能降低至理論去勢水平，且能夠維持至第28天。

Tab.1 Main pharmacokinetic parameters of goserelin sustained-release implant in rats by subcutaneous injection

Fig.4 Plasma concentration-time curves of testosterone in rats following subcutaneous injection of goserelin implant.±s，n=8.

3 討論

與已知戈舍瑞林的測定方法［7－8］相比，采用替代分析物法制備標(biāo)曲及質(zhì)控樣品測定睪酮。最低定量下限優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的 0.1 ng·mL－1，且專屬性好，更適用于低濃度戈舍瑞林樣品的測定。方法學(xué)數(shù)據(jù)表明，兩種方法均符合生物樣本測定［9］的要求，可用于戈舍瑞林的體內(nèi)藥代動力學(xué)及藥效動力學(xué)的分析。

戈舍瑞林緩釋植入劑在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線顯示其有2次達(dá)峰行為，初始峰值的產(chǎn)生是由于植入劑表面藥物的快速釋放，從而使得血藥濃度迅速達(dá)到較大水平，第2次達(dá)峰是由于植入劑骨架溶蝕，進(jìn)一步崩解而得。每只0.3～1.2 mg劑量范圍內(nèi)，隨著劑量的增加，藥代參數(shù) AUC0－t和cmax呈線性增加，其他參數(shù) Tmax，t1/2，MRT，Cl與Vd在不同劑量組間均無顯著性差異。提示該植入劑在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為在每只0.3～1.2 mg的劑量范圍內(nèi)呈線性藥代動力學(xué)特性。

在每只0.3～1.2 mg劑量范圍內(nèi)，睪酮變化趨勢相近，隨著劑量的增加，大鼠體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)果并未呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。在每只0.3 mg劑量水平的作用下，大鼠給藥4 d后睪酮濃度雖下降至較低水平，但未完全達(dá)到理論去勢水平，提示該制劑在此濃度水平下，未能達(dá)到預(yù)期藥效水平。在每只0.6～1.2 mg劑量范圍內(nèi)，大鼠給藥4 d后，各劑量組的睪酮濃度均能降低至理論去勢水平，睪酮變化趨勢無明顯不同，維持藥效至28 d。提示該制劑在每只0.6 mg以上劑量水平的作用下，對大鼠垂體GnRH受體產(chǎn)生長時(shí)間刺激后，導(dǎo)致受體完全脫敏，使得睪酮濃度達(dá)到去勢水平，此時(shí)達(dá)到預(yù)期藥效作用。

根據(jù)該制劑在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)及藥效動力學(xué)研究結(jié)果表明，其藥效作用的產(chǎn)生及維持可能與戈舍瑞林的初始刺激及后續(xù)的維持濃度有關(guān)。戈舍瑞林的初始刺激達(dá)到一定強(qiáng)度時(shí)，一段時(shí)間后均能使大鼠垂體GnRH受體達(dá)到脫敏狀態(tài)，進(jìn)而完全抑制睪酮濃度達(dá)去勢水平。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可對多種不同制劑處方的藥代動力學(xué)與藥效動力學(xué)進(jìn)行研究，進(jìn)一步增加樣本量，以確定兩者間的相關(guān)性。

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［9］Guideline on Bioanalytical Method Validation，European Medicines Agency，2011［B/OL］.http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf.