劉 姣，李明春，王培培，張 彬

(1.青島大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，山東青島 266071;2.解放軍第401醫(yī)院藥劑科，山東青島 266071)

時(shí)辰治療學(xué)是根據(jù)機(jī)體生理、病理節(jié)律以及治療方法本身節(jié)律的特點(diǎn)，制定最合理時(shí)間的治療方案，以達(dá)到最佳治療目的［1］。目前有多種抗腫瘤藥物如5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、長春瑞濱等單獨(dú)或聯(lián)合時(shí)辰化療方案已得到證實(shí)并應(yīng)用于臨床［2－4］。

鹽酸厄洛替尼(erlotinib)是一種選擇性地作用于表皮生長因子受體酪氨酸激酶的小分子靶向藥物。適用于既往接受過至少一個(gè)化療方案失敗后的局部晚期或轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌的二、三線治療。自問世以來，厄洛替尼以其高效低毒的優(yōu)勢贏得了廣泛的市場應(yīng)用前景，但是目前國內(nèi)外關(guān)于厄洛替尼時(shí)辰藥理學(xué)方面的研究還未見報(bào)道。本文主要通過HPLC測定荷瘤小鼠按時(shí)辰給予厄洛替尼血藥濃度，探討其時(shí)辰藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)借鑒了之前的晝夜節(jié)律的研究方法，包括人工晝夜的設(shè)置條件及荷瘤小鼠明暗期適應(yīng)性飼養(yǎng)等，實(shí)驗(yàn)方法基本遵循國際認(rèn)可的時(shí)辰藥理學(xué)研究原則［5－7］。此前有文獻(xiàn)應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用測定體內(nèi)樣品中厄洛替尼的濃度［8］，而我們在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上在安全范圍內(nèi)采用了高劑量，最終血藥濃度完全能夠滿足定量要求，且方法簡便、靈敏、可靠。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器

鹽酸厄洛替尼片〔瑞士羅氏有限公司，批號(hào):國藥準(zhǔn)字 J20090116，每片150 mg(以厄洛替尼計(jì))〕;刮去包衣，研磨至粉末狀后溶于0.5%CMCNa溶液中，使其濃度為15 g·L－1。給藥前超聲0.5 h。鹽酸厄洛替尼對照品、索拉非尼對照品均購自加拿大TRC公司;乙腈(色譜純);三氟乙酸、正己烷、乙酸乙酯等其他試劑均為分析純。

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);DV215CD型電子天平(美國 OHAUS);TCL16離心機(jī)(長沙英泰儀器有限公司);DC-24型氮吹儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司);WH-1微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);STARTER 3C實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海奧豪斯儀器有限公司)。

1.2 動(dòng)物

550只雌性C57BL小鼠，體質(zhì)量9～13 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SPF級(jí) ，許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001。將小鼠置于恒溫(24±2)℃，恒濕(70±10)%，嚴(yán)格控制12 h光照(7:00～19:00)，12 h黑暗的安靜的環(huán)境中，明期照度(500±10)lx，暗期照度(20±5)lx，自由飲水、攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)3周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 腫瘤模型建立

Lewis肺癌細(xì)胞(來源ATCC)購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，密度為1×107L－1的細(xì)胞懸液，每只小鼠右腹股溝皮下注射0.2 mL。

接種腫瘤10 d后，選擇種瘤成功的小鼠504只，隨機(jī)分為6組，每組84只，分別于8:00，12:00，16:00，20:00，24:00和4:00單次單劑量ig給予鹽酸厄洛替尼150 mg·kg－1(每只小鼠ig給予0.2 mL)。各組給藥前12 h禁食。各組分別于給藥后5，10，20，30，45 min，1.5，3，5，8，12，16和24 h時(shí)間點(diǎn)每組取7只，摘眼球取血0.5 mL，4000×g離心10 min分離血漿，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血藥濃度測定

1.4.1 溶液配制

精密稱取鹽酸厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)品4.56 mg，用流動(dòng)相溶解配制成濃度為0.456 g·L－1儲(chǔ)備液;精密稱取索拉非尼標(biāo)準(zhǔn)品2.13 mg，用流動(dòng)相溶解配制成濃度為0.0852 g·L－1內(nèi)標(biāo)液。均于4℃存放備用。

1.4.2 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確吸取血漿樣品100 μL于1.5 mL EP管中，依次加入 20 μL 內(nèi)標(biāo)(0.0852 g·L－1)，50 μL NaOH(0.1 mol·L－1)，1 mL 正己烷-乙酸乙酯30∶70(V/V)，渦旋振蕩 5 min，12 000 ×g 離心10 min。取上清液，45℃氮?dú)獯蹈?，?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋5 s，12 000×g離心5 min后進(jìn)樣，進(jìn)樣量 20 μL。

1.4.3 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);保護(hù)柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×12.5 mm，5 μm);柱溫:25℃;流動(dòng)相:乙腈-水(三氟乙酸調(diào)節(jié) pH 2.0)(55∶45 V/V);流速:1.00 mL·min－1;檢測波長:250 nm。流動(dòng)相條件及血樣處理方法參考文獻(xiàn)［9－10］。

1.4.4 專屬性考察

取空白血漿、空白血漿+鹽酸厄洛替尼+內(nèi)標(biāo)、血漿樣品按1.4.3項(xiàng)下方法操作，按1.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽酸厄洛替尼和內(nèi)標(biāo)索拉非尼的出峰時(shí)間分別為2.99和11.6 min。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對檢測無干擾(圖1)。

Fig.1 Chromatograms of erlotinib and sorafenib(internal standard).A:blank mouse plasma;B:blank plasma containing erlotinib 14 896 μg·L －1and sorafenib 17 040 μg·L －1;C:the detection limit(the concentration of erlotinb was 465.5 μg·L －1and that of sorafenib was 17 040 μg·L －1);D:plasma sample after administration(the concentration of erlotinb was 22 500 μg·L －1and that of sorafenib was 17 040 μg·L －1).

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

將厄洛替尼儲(chǔ)備液用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取10 μL，加入 90 μL 空白血漿配成終濃度分別為 44 688，22 344，14 896，11 172，7448，2793，1396.5和465.5 μg·L－1，然后按1.4.3項(xiàng)下血漿處理方法處理。將測得的厄洛替尼與內(nèi)標(biāo)面積比(R)對藥物濃度(c)進(jìn)行線性回歸計(jì)算(加權(quán)系數(shù)1·c－2)，回歸方程為:R=4 ×10－5c+0.0193(r=0.9996)。血漿中厄洛替尼濃度在465.5～44688 μg·L－1范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。

1.4.6 最低檢測濃度

取90 μL空白血漿，加入10 μL厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液 4655 μg·L－1，使其終濃度為 465.5 μg·L－1。在方法確證的第2天對濃度樣品進(jìn)行5樣本分析，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣本濃度，計(jì)算得到該濃度下的精密度RSD為6.29%，準(zhǔn)確度RE為10.74%，滿足定量要求。

1.4.7 精密度和準(zhǔn)確度

按1.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線測定項(xiàng)下方法配制厄洛替尼濃度分別為35 750.4，4468.8 和558.6 μg·L－1的質(zhì)控溶液各5份，連續(xù)測定3次，計(jì)算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度，日內(nèi)精密度分別為 6.7%，9.1%和15.7%，準(zhǔn)確度分別為 12.9%，8.8%和 －14.1%(表1)。連續(xù)測定3 d，隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控樣品濃度，計(jì)算日間精密度和準(zhǔn)確度，日間精密度分別為4.7%，6.7%和14.1%，準(zhǔn)確度分別為14.3%，4.6%和 －16.4%(表1)。

Tab.1 Precision，accuracy and recovery of erlotinib in mouse plasma

1.4.8 回收率

配制35 750.4，4468.8 和558.6 μg·L－1質(zhì)控溶液各5份，按1.4.3血漿處理和1.4.1色譜條件進(jìn)行HPLC分析，得血漿中厄洛替尼峰面積。配制同濃度厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液，同樣方法處理并進(jìn)樣分析得厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)液峰面積。以厄洛替尼血漿樣品峰面積與標(biāo)準(zhǔn)液峰面積的比值求算提取回收率。回收率分別為(92.4 ±7.2)%，(96.5 ±4.7)%以及(88.0 ±4.7)%(表1)。

1.4.9 樣品穩(wěn)定性

厄洛替尼血漿樣品在室溫避光放置24 h，－20℃～37℃反復(fù)凍融3次以及－80℃存放1個(gè)月之后的穩(wěn)定性結(jié)果見表2，表明厄洛替尼在上述條件下均穩(wěn)定。

Tab.2 Precision and accuracy of erlotinib in mouse plasma under different storage conditions

2 結(jié)果

厄洛替尼ig給藥后在荷瘤小鼠體內(nèi)不同時(shí)辰點(diǎn)的平均藥-時(shí)曲線見圖2。根據(jù)血藥濃度采用WinNonlin軟件計(jì)算(表 3)。20:00給藥組和24:00給藥組的曲線下面積(AUC)明顯比8:00，12:00，16:00和4:00給藥組低，而8:00和12:00給藥組的 AUC0～24h較高(分別為 440 083 μg·L－1·h，450 289 μg·L－1·h)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P ＜0.01)。平均滯留時(shí)間(mean residence time，MRT)變化趨勢與AUC基本一致，12:00給藥組MRT0～24h最高(10.277 h，P ＜0.01)。4:00，8:00，12:00 給藥組的MRT cmax相較其他3組為高，差異有顯著性(P＜0.01)。6個(gè)組給藥時(shí)間點(diǎn)Tmax總體有顯著性差異(P＜0.01)，其中8:00給藥組最大(12.8 h)。6個(gè)給藥時(shí)間點(diǎn)之間清除率(Cl)差異有顯著性(P＜0.01)，20:00給藥組的 Cl明顯高于其他組(Clz/F=0.568 L·h－1·kg－1，P ＜0.01)。

Fig.2 Plasma concentration-time profile of erlotinib after administration at six different time points of the day.

Tab.3 Pharmacokinetic parameters in blood of each group after erlotinib administration

3 討論

厄洛替尼代謝的主要部位是在肝，而肝血流量、肝藥酶的活性以及血漿蛋白水平均會(huì)影響其體內(nèi)過程。研究表明，小鼠肝、腎部位血流量有晝夜節(jié)律變化，在活動(dòng)期的血流量、白蛋白水平均較休息期增多，高峰出現(xiàn)在 21:00 ～3:00［11－12］。因而本研究中，20:00和24:00給藥組的Cl明顯高于其他給藥組，且Tmax小，達(dá)到峰值濃度快，而8:00，12:00給藥組的Tmax明顯較其他組高，出現(xiàn)這種早晚差異的原因可能是暗期是小鼠活動(dòng)期，血流量大，流速快，藥物吸收代謝速度較快有關(guān)。此外，cmax的峰值出現(xiàn)在12:00組，且8:00和12:00給藥組的AUC和MRT均明顯高于其他各組，而20:00和24:00給藥組峰值濃度最低，AUC和MRT小，清除率高，由此說明雖然早上8:00和12:00給藥后吸收速度較慢，但藥物吸收較完全，在體內(nèi)作用時(shí)間長，反之，20:00～24:00用藥可能作用效果較凌晨和上午(4:00～12:00)弱。

本研究表明，厄洛替尼在荷瘤小鼠藥代動(dòng)力學(xué)具有時(shí)辰節(jié)律性特點(diǎn)，可以為探索厄洛替尼時(shí)辰給藥的藥效學(xué)以及其臨床時(shí)辰化療的應(yīng)用提供參考，但具體內(nèi)在機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。因此，下一步將對小鼠肝藥酶是否具有時(shí)辰節(jié)律性進(jìn)行研究，期望從藥物代謝角度解釋厄洛替尼在小鼠體內(nèi)過程的晝夜節(jié)律。

［1］He SX.Chronopharmacology and Chronotherapy(時(shí)間藥理學(xué)與時(shí)間治療學(xué))［M］.Tianjin:Tianjin Science and Technology Press，1994:8-15.

［2］Falcone A，Allegrini G，Antonuzzo A，Brunetti I，Pfanner E，Lencioni M，et al.Infusions of fluorouracil and leucovorin:effects of the timing and semi-intermittency of drug delivery［J］.Oncology，1999，57(3):195-201.

［3］Zhang Q，Jia ZP，Jiang NX，Wang R.The chronophamacokinetics ofmethotrexate［J］. Chin Hosp Pharm J(中國醫(yī)院藥學(xué)雜志)，2004，24(3):147-148.

［4］Filipski E，Amat S，Lemaigre G，Vincenti M，Breillout F，Lévi FA.Relationship between circadian rhythm of vinorelbine toxicity and efficacy in P388-bearing mice［J］.J Pharmacol Exp Ther，1999，289(1):231-235.

［5］Hrushesky WJ，Langevin T，Kim YJ，Wood PA.Circadian dynamics of tumor necrosis factor alpha(cachectin)lethality［J］.J Exp Med，1994，180(3):1059-1065.

［6］Bruguerolle B，Prat M.Circadian phase dependent acute toxicity and pharmacokinetics of etidocaine in serum and brain of mice［J］.J Pharm Pharmacol，1990，42(3):201-202.

［7］Portaluppi F，Smolensky MH，Touitou Y.Ethics and methods for biological rhythm research on animals and human beings［J］. Chronobiol Int，2010，27(9-10):1911-1929.

［8］Huang YS，Zhou ZL，Lei LC，Zhao JH，Huang CQ，Deng HM，et al.Determination of erlotinib in human plasma by HPLC-MS/MS［J］.Cent South Pharm(中南藥學(xué))，2011，9(11):801-804.

［9］Lepper ER，Swain SM，Tan AR，F(xiàn)igg WD，Sparreboom A.Liquid-chromatographic determination of erlotinib(OSI-774)，an epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2003，796(1):181-188.

［10］Faivre L，Gomo C，Mir O，Taieb F，Schoemann-Thomas A，Ropert S，et al.A simple HPLC-UV method for the simultaneous quantification of gefitinib and erlotinib in human plasma［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2011，879(23):2345-2350.

［11］Gandhi A，Moorthy B，Ghose R.Drug disposition in pathophysiological conditions［J］.Curr Drug Metab，2012，13(9):1327-1344.

［12］Hecquet B，Meynadier J，Bonneterre J，Adenis L，Demaille A.Time dependency in plasmatic protein binding of cisplatin［J］.Cancer Treat Rep，1985，69(1):79-83.