李琳琳，周培嵐，蘇瑞斌

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所新藥評(píng)定研究室，北京 100850)

神經(jīng)病理性痛(neuropathic pain，NPP)是指由軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病造成的疼痛，是中樞及外周神經(jīng)組織由于多種原因受到損傷或出現(xiàn)功能障礙而引起的一種慢性病理性疼痛，主要表現(xiàn)為痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)超敏及持續(xù)性自發(fā)痛［1］。由于NPP發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，因此成為較難治療的疾病。

嘌呤能P2X4受體是ATP－門控、非選擇性陽(yáng)離子通道P2X受體家族成員，廣泛分布于哺乳動(dòng)物腦、脊髓、肺、膀胱和輸卵管等組織中，在腦及脊髓表達(dá)量較高。近年來(lái)研究表明，P2X4受體在NPP發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能具有重要的調(diào)節(jié)作用。一方面，脊髓損傷后，隨著大鼠痛覺(jué)敏感性的增加，脊髓P2X4受體表達(dá)量相應(yīng)上調(diào)，顯示P2X4受體激活與痛覺(jué)敏感性密切相關(guān)［2］;另一方面，當(dāng)敲除小鼠的P2X4受體后，外周神經(jīng)損傷引起的NPP的發(fā)展明顯改善［3］。上述研究提示，如能在 NPP形成初期調(diào)節(jié)P2X4受體的表達(dá)或功能，可能會(huì)對(duì)治療NPP起到較大的作用。

2009年，Kawate等［4］首次解析了斑馬魚P2X4(zfP2X4)受體的晶體結(jié)構(gòu)。2012年，Young等［5］將zfP2X4受體結(jié)合ATP開(kāi)放狀態(tài)晶體結(jié)構(gòu)分辨率提升至2.8?。zfP2X4受體晶體結(jié)構(gòu)的解出為P2X4受體分子機(jī)制及功能的探索奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)P2X4受體的功能進(jìn)行了初步探索。研究表明，P2X4受體在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量較高，其對(duì)NPP的調(diào)節(jié)起著重要作用。當(dāng)有害刺激發(fā)生時(shí)，體內(nèi)釋放ATP激活P2X4受體，胞外Ca2+內(nèi)流，并進(jìn)一步刺激下游信號(hào)分子，引起胞內(nèi)Cl－濃度改變，改變胞內(nèi)Cl－的穩(wěn)態(tài)平衡，最終產(chǎn)生NPP反應(yīng)［6］。P2X4受體可以被ATP及其類似物激活，其非選擇性拮抗劑主要有三硝基苯酚(trinitrophenyl，TNP)－ATP［7－8］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，P2X4受體與高血壓及腫瘤等疾病的發(fā)生也有一定的聯(lián)系［9－11］。由于目前缺乏高選擇性P2X4受體激動(dòng)劑和拮抗劑，無(wú)法特異性地開(kāi)展P2X4受體的生理功能研究。因此，本實(shí)驗(yàn)擬建立穩(wěn)定表達(dá)大鼠 P2X4受體(rP2X4)的 HEK293 細(xì)胞系(HEK293－pEGFP－N1－rP2X4)，以期為研究P2X4受體的生理功能及靶向P2X4受體的藥物提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

E.coli DH5α菌株購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供。pEGFP－N1－GFP載體由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所叢玉文教授惠贈(zèng)，pExpress－1－P2rx4購(gòu)自美國(guó)Source BioScience公司。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，質(zhì)粒小提試劑盒、Fast HiFidelity PCR Kit購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，引物由北京奧克鼎盛生物科技有限公司合成，EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司;G418、胰蛋白酶購(gòu)自 Amresco公司，MEM培養(yǎng)基(粉劑)、Opti－MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自中國(guó)ExCell Biology公司;抗P2X4受體兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，抗β肌動(dòng)蛋白小鼠單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司;5×加樣緩沖液、ECL顯影試劑盒購(gòu)自普利來(lái)公司，產(chǎn)品蛋白預(yù)染相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物購(gòu)自立陶宛Fermentas公司;Power SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自美國(guó) Life Technologies公司;ATP 購(gòu)自中國(guó) J＆K Chemical公司，TNP－ATP購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，電泳槽購(gòu)自美國(guó)Bio－Rad公司，凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Kodak公司;熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司;電極微管、P－97型水平拉制儀、M－225型三維微操儀購(gòu)自美國(guó) Sutter Instrument公司;DigiData 1322A數(shù)－模轉(zhuǎn)換器、MultiClamp 700B型膜片鉗放大器購(gòu)自美國(guó)Axon Instrument公司。

1.2 pEGFP－N1－rP2X4重組質(zhì)粒構(gòu)建

以 pExpress－1－P2rx4質(zhì)粒為模板，采用上游引物:5'－GCCTCGAGGCGGGCTGCTG－3'，下 游 引物:5'－CCGAATTCCTCACTGGTTCATCTCC－3'，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95℃ 2 min;95℃15 s，62℃ 10 s，70℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后膠回收，回收產(chǎn)物用XhoⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后再次膠回收，并與雙酶切pEGFP－N1載體連接(14℃過(guò)夜)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μL E.coli DH5α感受態(tài)，混勻并于冰浴中靜置30 min，42℃水浴中60 s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻3 min;加入預(yù)熱的450 μL SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)后混勻，其后于37℃，250 r·min－1震搖45 min;取轉(zhuǎn)化菌液300 μL均勻涂布于卡那霉素陽(yáng)性的LB固體培養(yǎng)平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜;挑取培養(yǎng)板上的單克隆接種于含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)液，37℃，250 r·min－1震蕩培養(yǎng) 8 h。應(yīng)用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將含目的條帶的克隆測(cè)序(北京奧克鼎盛生物科技有限公司)，測(cè)序結(jié)果以PubMed Blast進(jìn)行序列比對(duì)，序列完全正確的重組質(zhì)粒用于建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

1.3 rP2X4受體穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞系建立

將HEK293細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞60%～70%匯片時(shí)，用Lipofectamine 2000將pEGFP－N1－rP2X4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，移除含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入MEM完全培養(yǎng)基;轉(zhuǎn)染24 h后，觀察GFP熒光。用胰酶消化并轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，加入 G418 1 g·L－1［12］壓力篩選 8 d，消化細(xì)胞并稀釋傳至96孔板;培養(yǎng)3 d后，挑選單細(xì)胞孔繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底后，轉(zhuǎn)種至24孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 單克隆綠色熒光篩選細(xì)胞株

將細(xì)胞傳至24孔板玻璃片，培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)基并用500 μL 4%多聚甲醛固定，用PBS清洗后加 入 300 μL 1 μmol·L－1Hoechst 溶 液 染 核30 min;再用PBS清洗后，封片并用激光共聚焦顯微鏡觀察選出綠色熒光強(qiáng)度較高的細(xì)胞株。

Tab.1 PCR and qRT－PCR primers

1.5 qRT－PCR驗(yàn)證rP2X4受體mRNA的表達(dá)

采用 Primer 3.0軟件設(shè)計(jì) qRT－PCR引物(表1)。分別取培養(yǎng)24h的HEK293細(xì)胞及HEK293－pEGFP－N1－rP2X4細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA并以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA一鏈。反應(yīng)體系:1 μg 總 RNA，4 μL 5 × 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，2 μL dNTPs Mix 10 mmol·L－1，1 μL RRI 40 U·μL－1，1 μL oligo d(T)1850 μmol·L－1，0.5 μL M－MLv 200 U·μL－1，加 DEPC H2O 至20 μL。逆轉(zhuǎn)錄 條 件:40℃ 1 h，70℃ 10 min。 逆 轉(zhuǎn)錄得cDNA一鏈并進(jìn)行qRT－PCR反應(yīng)。qRT－PCR反應(yīng)體系:0.6 μL 模板 cDNA，4.0 μL DEPC H2O，5 μL 2×PCR Master Mix，上下游引物10 μmol·L－1各0.2 μL;反應(yīng)條件:95℃ 2 min;95℃ 15 s，62℃10 s，70℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。以 2－ΔΔCt表示基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) HEK293－pEGFP－N1－rP2X4上 rP2X4受體蛋白的表達(dá)

取培養(yǎng) 24 h的 HEK293細(xì)胞及 HEK293－pEGFP－N1－rP2X4細(xì)胞，用PBS清洗后加入預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞并于4℃旋搖15 min;4℃，12 000×g離心15 min，取上清測(cè)定蛋白濃度，剩余蛋白清液加入5×梯度緩沖液加熱變性5 min，10%SDS－PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至 NC膜上，含5%脫脂奶粉的TBS－T緩沖液室溫封閉1.5 h;剪下其相應(yīng)位置膜，分別加入P2X4受體一抗(1∶50)及β 肌動(dòng)蛋白一抗(1∶4000)，4℃孵育過(guò)夜，TBS－T 緩沖液洗膜后分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶3000)及山羊抗小鼠二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h。TBS－T和TBS緩沖液洗膜后加入ECL顯影液，曝光。

1.7 全細(xì)胞膜片鉗法記錄電流

利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄單細(xì)胞離子通道電流。培養(yǎng)24 h，用細(xì)胞外液清洗后置于倒置顯微鏡工作臺(tái);選取大小相近、紋理清晰的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。保持細(xì)胞外液灌流，流速1.5 mL·min－1。電極入液后電阻為4.0～5.0 MΩ，液接電位補(bǔ)償，形成高阻封接后，進(jìn)行電容補(bǔ)償。負(fù)壓破膜后，進(jìn)行全細(xì)胞電容補(bǔ)償、串聯(lián)電阻補(bǔ)償。待細(xì)胞穩(wěn)定后，在Gap free模式下記錄ATP激活電流。采用自身對(duì)照觀察多次給藥后同一細(xì)胞的電流變化。在電壓鉗模式下記錄細(xì)胞電流。細(xì)胞破膜穩(wěn)定后，每隔1 min向細(xì)胞表面噴射藥物(噴射時(shí)間6 ms)。給藥后保持細(xì)胞外液以1.5 mL·min－1的流速灌流。給藥順序?yàn)?ATP 3.0 μmol·L－1，ATP 3.0 μmol·L－1，TNPATP 30.0 μmol·L－1+ATP 3.0 μmol·L－1混合溶液、ATP 3.0 μmol·L－1。

細(xì)胞內(nèi)液(mmol·L－1)［13］:KCl 140，MgCl22，TEA－Cl 2，EGTA 11，HEPES 10，用 KOH 調(diào)節(jié) pH 7.2，滲透壓為 300 ～320 mOsmol·kg－1;細(xì)胞外液(mmol·L－1):NaCl 140，KCl 5.4，MgCl20.5，CaCl22，HEPES 10 和D－葡萄糖10，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 7.4，滲透壓為 310 ～330 mOsmol·kg－1。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建pEGFP－N1－rP2X4 重組質(zhì)粒

pExpress－1－P2rx4擴(kuò)增結(jié)果與1166bp的P2rx4吻合，目的條帶膠回收、經(jīng)雙酶切后與pEGFPN1連接并轉(zhuǎn)化(圖1A);陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒用XhoI和EcoRI限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定(圖1B)，表明rP2X4基因成功克隆至pEGFP－N1載體。重組質(zhì)粒測(cè)序后，通過(guò) PubMed Blast驗(yàn)證，與 GenBank BC078792.1 序列 100%吻合。pEGFP－N1－rP2X4重組質(zhì)?？捎糜诜€(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建。

Fig.1 Construction of rP2X4product(A)and recombinant plasmids pEGFP－N1－rP2X4digested with XholⅠ and EcoR(B).M:marker.Lane 1 was construction of rP2X4product in A and recombinant plasmids pEGFP－N1－rP2X4in B.

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及單克隆

熒光顯微鏡下觀察，確定轉(zhuǎn)染效率為30% ～40%。經(jīng)G418篩選，獲得可能穩(wěn)定表達(dá) pEGFPN1－rP2X4細(xì)胞的單克隆20個(gè)。對(duì)所得單克隆進(jìn)行綠色熒光篩選、激光共聚焦顯微鏡觀察，篩選出熒光強(qiáng)度較高的細(xì)胞株，P2X4受體分布于胞漿與胞膜上，在胞漿中呈點(diǎn)簇狀分布(圖2A)，Hoechst染核后，細(xì)胞核呈藍(lán)色(圖2B)，兩圖疊合成完整細(xì)胞(圖2C)。

Fig.2 Green fluorescence screening of HEK293－pEGFP－N1－rP2X4.A:GFP－rP2X4;B:cell nucleus;C:merge.

2.3 rP2X4受體mRNA在HEK293－pEGFP－N1－rP2X4細(xì)胞系的表達(dá)水平

表2 結(jié)果顯示，HEK293－pEGFP－N1－rP2X4 細(xì)胞系在傳代1，3，5，10，15，20 和 25 代后均能穩(wěn)定表達(dá) rP2X4受體mRNA(P＜0.05)，提示在基因水平該細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)rP2X4受體。

Tab.2 Level of rP2X4receptor mRNA in HEK293－pEGFP－N1－rP2X4cells of different generations

2.4 rP2X4受體蛋白在HEK293－pEGFP－N1－rP2X4細(xì)胞系rP2X4受體的蛋白表達(dá)水平

Western蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果(圖3)及處理后數(shù)據(jù)(表 3)顯示，HEK293－pEGFP－N1－rP2X4細(xì)胞系在傳代1，3，5，10，15，20和25代后均能穩(wěn)定表達(dá)rP2X4受體蛋白(P＜0.05)，提示在蛋白水平該細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)rP2X4受體。

Fig.3 rP2X4receptor protein level in HEK293－pEGFP－N1－rP2X4 cells of different generations by Western blotting.Lane 1－7 were the 1st，3rd，5th，10th，15th，20th and 25th generation，respectively.

Tab.3 Level of rP2X4receptor protein in HEK293－pEGFP－N1－rP2X4cells of different generations

2.5 rP2X4受體電流在HEK293－pEGFP－N1－rP2X4細(xì)胞表現(xiàn)

Fig.4 rP2X4receptor current recording in HEK293－pEGFP－N1－rP2X4cells.A1:ATP 3.0 μmol·L －1ejected to cell at first time;A2:ATP 3.0 μmol·L －1ejected to cell at second time;A3:ATP 3.0 μmol·L －1and TNP－ATP 30.0 μmol·L －1ejected to cell at third time;A4:ATP 3.0 μmol·L －1ejected to cell at forth time;ejection time:6ms，ejection distance:1 min.B was the semi quantitative result of A(consequences of generation 6 and 25).A2ATPcurrent amplitude=100%;A3ATPcurrent amplitude=ADcurrent(pA)/A2current×100%.x ± s，n=3.*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01，(pA)compared with eject ATP 3.0 μmol·L －1.

傳代第6代及第25代細(xì)胞的電流，如圖4A，B所示。非選擇性P2X4受體拮抗劑TNP－ATP能顯著抑制 ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞電流，其中在第6代HEK293－pEGFP－N1－rP2X4細(xì)胞上，TNP－ATP 對(duì)ATP激活電流的抑制率為45.18%(P＜0.01)，在第25代細(xì)胞上，其抑制率為70.91%(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，新構(gòu)建的 HEK293－pEGFP－N1－rP2X4細(xì)胞系上不僅穩(wěn)定表達(dá)了P2X4受體，而且該受體在激動(dòng)劑刺激下表現(xiàn)出完整的電生理學(xué)功能。

3 討論

1977年，Graham等［14］以人腺病毒5型DNA剪接體感染人胚腎細(xì)胞使之轉(zhuǎn)化為如今廣泛使用的表達(dá)工具HEK293細(xì)胞系。該細(xì)胞系具有易培養(yǎng)、繁殖快、可采用多種方法轉(zhuǎn)染且能高效表達(dá)轉(zhuǎn)染蛋白、可靠地進(jìn)行蛋白翻譯與加工、適合于電壓鉗實(shí)驗(yàn)等特點(diǎn)［15］。鑒于此，本研究選擇了該細(xì)胞系為載體進(jìn)行rP2X4受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，以期能得到可穩(wěn)定表達(dá)rP2X4受體且適合進(jìn)行該受體機(jī)制研究的細(xì)胞系。

本研究在基因水平及蛋白水平對(duì)細(xì)胞系rP2X4受體進(jìn)行確證時(shí)，rP2X4受體RNA及蛋白的變化趨勢(shì)不一致，可能由于細(xì)胞中某種受體或細(xì)胞因子表達(dá)量增加時(shí)，其基因會(huì)先于蛋白表達(dá)增加。HEK293－pEGFP－N1－rP2X4細(xì)胞系在傳代3 代后基因水平表達(dá)量明顯升高，而其蛋白水平在傳代5代后可見(jiàn)明顯升高;細(xì)胞系傳代時(shí)每皿細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)可能有所不同，且由于RNA提取及蛋白提取步驟較多，可能會(huì)影響后續(xù)檢測(cè)，造成其基因與蛋白變化趨勢(shì)不一致。但從細(xì)胞系mRNA及蛋白水平檢測(cè)結(jié)果可以明顯看到該細(xì)胞系傳代25代各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)rP2X4受體基因水平及蛋白水平表達(dá)量與HEK293細(xì)胞有明顯差異，說(shuō)明細(xì)胞系能夠穩(wěn)定過(guò)表達(dá)rP2X4受體。

若目的基因與EGFP基因轉(zhuǎn)錄后翻譯形成融合蛋白，Western蛋白質(zhì)印跡法對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行蛋白水平rP2X4受體的確證，檢測(cè)時(shí)應(yīng)出現(xiàn)兩條rP2X4受體蛋白條帶，一條是HEK293細(xì)胞內(nèi)源性條帶，一條是轉(zhuǎn)染的外源性的EGFP－N1－rP2X4條帶。根據(jù)載體及目的基因性質(zhì)，將EGFP基因連接在目的基因C端，即在目的基因之后表達(dá)。目的基因帶有起始密碼子，而EGFP基因前自帶起始密碼子，重組基因含有兩個(gè)起始密碼子，后者干擾目的基因的起始密碼子，使二者不能在轉(zhuǎn)錄后翻譯形成融合蛋白而各自單獨(dú)表達(dá)。所以本研究得到的Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)圖中只有一條rP2X4受體蛋白條帶。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向穩(wěn)定表達(dá)rP2X4受體的細(xì)胞噴射ATP時(shí)，P2X4受體通道打開(kāi)，Ca2+內(nèi)流，形成細(xì)胞膜電流;多次給予ATP后，ATP激活電流達(dá)到穩(wěn)定;TNP－ATP能抑制ATP激活電流。給予TNPATP后，ATP激活電流不能馬上恢復(fù)，可能是由于P2X4受體與TNP－ATP結(jié)合時(shí)間較長(zhǎng)，未能完全解離;但明顯觀察到電流有部分恢復(fù)趨勢(shì)，表明細(xì)胞膜P2X4受體能夠再次結(jié)合ATP，證明該穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系功能完整。

綜上所述，本研究室建立了能夠穩(wěn)定高表達(dá)具有功能活性的 rP2X4受體的 HEK293－pEGFP－N1－rP2X4細(xì)胞系，為研究rP2X4受體與NPP的相關(guān)性及靶向rP2X4受體的抗NPP藥物奠定了基礎(chǔ)。

致謝:感謝軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所軍事毒理與生化藥理研究室張淑卓助理研究員在本研究膜片鉗技術(shù)方面給予的支持與幫助。

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