★ 李堅 易延逵 蔡光先 楊永華 (1.漣源市人民醫(yī)院藥劑科 湖南 漣源417100;2.南方醫(yī)科大學(xué) 廣東 廣州510515;.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長沙410006)

天然產(chǎn)物指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，它是建立在天然產(chǎn)物化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價天然產(chǎn)物及其半成品、成品質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。目前指紋圖譜已成為國際公認(rèn)的控制天然產(chǎn)物(尤其是中藥)質(zhì)量的最有效手段［1－3］。

神安顆粒是由天麻、五味子、丹參、百合花、酸棗仁、首烏藤等組成，具有補腦安神、寧心除煩之功效。其基本工藝為:天麻粉碎成微粉;丹參、五味子、百合花加90%乙醇滲漉提取其極性較小脂溶性成分;丹參、五味子、百合花醇提后藥渣與酸棗仁、夜交藤加水提取，最后加入適量輔料制成顆粒。神安顆粒主要成分如下幾類:以天麻素為代表的較高極性苷類成分;存在于丹參、五味子、百合花中的丹參醌類、五味子木脂素類成分、百合花色素類等脂溶性成分;另含有以斯皮諾素為代表的苷類成分，丹參素類成分。神安顆粒所含成分較復(fù)雜，要想制定其指紋圖譜可采用制定其“全指紋圖譜系”來全面控制其質(zhì)量。神安顆粒的“全指紋圖譜系”應(yīng)有以上各類成分的信息。本文主要探討神安顆粒中以天麻素為代表的苷類成分指紋圖譜的制定。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent數(shù)據(jù)處理軟件;SK1200H型超聲器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);

天麻素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110736－200423，供含量測定用);磷酸為色譜純試劑(Fisher)，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

天麻、五味子、丹參、百合花、酸棗仁、首烏藤等藥材(長沙海川醫(yī)藥有限公司)，神安顆粒(自制)。

2 方法與結(jié)果

照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)，參照指紋圖譜的有關(guān)技術(shù)要求進(jìn)行測定［4］。

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱:C18柱;流動相:0.05%磷酸溶液;檢測波長:220nm。理論板數(shù)按天麻素峰計算應(yīng)不低于5000［5］。

2.1.2 供試品溶液的制備 取神安顆粒0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加稀乙醇10mL，精密稱定，超聲(功率200W，頻率40kHz)提取 30min，放冷，再精密稱定重量，減失的重量用稀乙醇補足，濾過，取續(xù)濾液5mL，濃縮至近干，殘渣加稀乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.3 參照物的選擇和制備

神安顆粒中苷類成分主要為天麻中的苷類成分，天麻素為天麻的指標(biāo)成分，因而選用天麻素為參照物。

對照品溶液的制備:精密稱取天麻素對照品(80℃干燥1h)適量，加流動相制成每1mL中含天麻素50μg的溶液，即得。

2.1.4 測定法

分別精密吸取參照物溶液10μL與供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，記錄時間為50min。以天麻素的色譜峰(S峰)的保留時間和峰面積為1計算其它各峰相對保留時間和相對峰面積。相似度評價采用“中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統(tǒng)”進(jìn)行。

表1 十批神安顆粒樣品中苷類成分各共有峰的相對保留時間

圖1 HPLC圖譜

2.1.5 神安顆粒中苷類成分指紋圖譜的建立(1)共有指紋峰的標(biāo)定 共有指紋峰采用相對保留時間標(biāo)定，以圖譜中天麻素為參照物，將各色譜峰保留時間與同一圖譜中參照物天麻素的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間，計算神安顆粒10個批次指紋圖譜中各色譜峰的相對保留時間，結(jié)果見表1。其中5個色譜峰為各批次神安顆粒所共有，故標(biāo)定它們?yōu)楣灿兄讣y峰，結(jié)果見圖1。5個共有指紋峰的相對保留時間分別為峰－1(0.2558～0.2566)、峰 － 2(0.3481 ～ 0.3521)、峰 － 3(0.4429 ～0.4446)、峰 －4(0.4963 ～0.5016)、峰 －S(1.0000)。

(2)共有指紋峰的相對峰面積 以圖譜中天麻素為參照物，將各色譜峰峰面積與同一圖譜中參照物天麻素的峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對峰面積，結(jié)果見表2。因神安顆粒中苷類成分指紋圖譜峰數(shù)少，對單峰峰面積占總峰面積＜10%的共有峰也進(jìn)行了計算。

表2 十批神安顆粒樣品中苷類成分各共有峰的相對峰面積

(3)相似度評價 相似度評價采用“中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統(tǒng)”，自動譜峰匹配。結(jié)果見圖2。結(jié)果10批樣品的相似度均在0.80以上。

圖2 相似度計算(全譜)圖

2.1.6 方法學(xué)考查 (1)精密度試驗 取同一份神安顆粒的供試品溶液，連續(xù)測定5次，對色譜中各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，結(jié)果見表3～4。結(jié)果符合指紋圖譜精密度的要求(RSD＜2%)。

表3 相對保留時間精密度結(jié)果(n=5)

(2)重復(fù)性試驗取同一批神安顆粒樣品5份，分別按“2.1.2項下供試品溶液制備方法”制備成供試品溶液，依法測定，對色譜中各共有指紋峰的相對保留時間、相對峰面積進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果各共有指紋峰的相對保留時間、相對峰面積基本一致，結(jié)果見表5～6。符合指紋圖譜重復(fù)性的要求(RSD＜2%)。

表4 相對峰面積精密度結(jié)果(n=5)

表5 相對保留時間重復(fù)性結(jié)果(n=5)

表6 相對峰面積重復(fù)性結(jié)果(n=5)

(3)穩(wěn)定性試驗取同一份神安顆粒的供試品溶液，分別在以下時間進(jìn)樣:0，2，4，6，8h，對色譜中各共有指紋峰的相對保留時間、相對峰面積結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果各共有指紋峰的相對保留時間、相對峰面積基本一致，表明神安顆粒供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表7～8。結(jié)果符合指紋圖譜穩(wěn)定性的要求(RSD＜2%)。

表7 相對保留時間穩(wěn)定性結(jié)果(n=5)

表8 相對峰面積穩(wěn)定性結(jié)果(n=5)

2.1.7 指紋圖中指紋峰與藥味的相關(guān)性考查 為了確定神安顆?！叭讣y圖譜系”中苷類成分指紋圖譜中指紋峰的來源，需要考查缺味神安顆粒和藥材的指紋圖譜，通過與相應(yīng)缺味陰性樣品和藥材進(jìn)行對比分析，考查指紋圖中指紋峰與藥味的相關(guān)性。這里主要對苷類成分指紋圖譜與天麻藥材的相關(guān)性進(jìn)行考查。

2.1.7.1 供試品溶液的制備 天麻供試品溶液制備:按供試品溶液制備方法，取天麻藥材粗粉1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10mL，稱定重量，超聲處理(功率:240W，頻率:45Hz)1h，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性供試品溶液制備:取缺天麻藥材的神安顆粒約1g，按上述制備方法進(jìn)行制備。

2.1.7.2 色圖譜的制定 分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，記錄50分鐘的色譜圖。分別比較各待測溶液指紋圖譜，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明神安顆粒苷類成分指紋圖譜s號峰來源于天麻。

圖3 指紋圖譜對比分析

3 討論

3.1 神安顆?！叭讣y圖譜系” 中藥的“全指紋圖譜系”應(yīng)根據(jù)方中藥物的信息、成分分析、功能主治相關(guān)藥效作用等，確定中藥所含有的具體各類成分，進(jìn)而根據(jù)每一類成分的提取方法和儀器條件制定出相應(yīng)的指紋圖譜，并進(jìn)一步確定中藥“全指紋圖譜系”中每張指紋圖譜中每一個指紋峰的來源。在對神安顆粒指紋圖譜的研究中，因神安顆粒成分復(fù)雜，一張指紋圖譜難以反映大部分成分的信息，故進(jìn)行了“全指紋圖譜系”研究，建立了以天麻素為代表的苷類成分、以五味子醇甲為代表的脂溶性成分和以斯皮諾素為代表的水溶性成分的指紋圖譜，主要探討了以天麻素為代表的苷類成分指紋圖譜的研究，并與天麻藥材和缺天麻樣品進(jìn)行了相關(guān)性分析，確定了部分指紋峰的來源。

3.2 區(qū)間指紋圖譜的構(gòu)思 針對指紋圖譜分析結(jié)果中雜質(zhì)峰群存在，本文提出了“區(qū)間指紋圖譜”的構(gòu)建，即是建立某一區(qū)間的指紋圖譜:整個指紋圖譜把它分為幾個區(qū)間(時間段)，在一定區(qū)間內(nèi)可能雜質(zhì)峰群比較集中，可不對這一區(qū)間的雜質(zhì)峰群進(jìn)行指紋峰的定位，而對一定區(qū)間內(nèi)色譜峰均分離較好的組峰尤其是參比峰所在區(qū)間進(jìn)行指紋峰的定位，從而構(gòu)建起這一區(qū)間的指紋圖譜。這可以很好的解決指紋圖譜研究中出現(xiàn)的雜質(zhì)峰群問題，從而為天然產(chǎn)物指紋圖譜的建立打開了新的思路和方法，也為指紋圖譜建立的可行性提供了更多的試驗依據(jù)。

3.3 神安顆?！皡^(qū)間指紋圖譜” 在對神安顆粒指紋圖譜的研究中，因神安顆粒成分復(fù)雜，故建立神安顆粒中以天麻素為代表的苷類成分指紋圖譜。在研究以天麻素為代表的苷類成分指紋圖譜中，優(yōu)化了色譜條件。在區(qū)間0～10min內(nèi)有大量的雜質(zhì)峰群，而在區(qū)間10～50min內(nèi)主要指紋峰分離較好，因而選擇了這一區(qū)間建立了神安顆粒苷類成分的指紋圖譜。

［1］Natalie Lazarow ych.Use of Fingerprinting and Marker Compounds for Identification and Standardization of BotanicalDrugs:Strategies for Applying Pharmaceutical HPLC Analysis to Herbal Products［J］.Drug Inf ormation Journal，1998，32:497 －512.

［2］Peter John Houghton.Establishing Identification Criteria for Botanicals［J］.Drug In formation Journal，1998，32:461 －469.

［3］任德權(quán).中藥指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)的意義與作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2001，12(3):135 －140.

［4］國家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》的通知［J］.中成藥，2000，22(10):671－675.

［5］黃小玲，楊春燕，袁慧文.天麻藥材高效液相色譜指紋圖譜研究［J］.中國藥業(yè)，2011，20(2):17 －19.