唐立群++黃世文++侯雨萱

摘要：酵母雙雜交是常用的蛋白-蛋白檢測技術(shù)。以水稻受精5 d的幼嫩種子為材料，構(gòu)建了適用于水稻種子發(fā)育相關(guān)蛋白的互作蛋白酵母雙雜交篩選平臺，cDNA文庫容量達(dá)到1.1×106，平均插入大小約為750 bp，開發(fā)了改良的酵母菌落PCR方法，用于文庫插入片段的擴(kuò)增，大大提高了篩選效率。NAC是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物發(fā)育、抗逆等多個(gè)方面發(fā)揮著重要功能。RT-PCR結(jié)果顯示，NAC家族成員ONAC023在種子中特異表達(dá)，可能調(diào)控種子早期發(fā)育。以O(shè)NAC023為誘餌，成功地篩選到21個(gè)互作蛋白候選基因，其中包含1個(gè)DNA linding protein，推測其可能是ONAC023蛋白復(fù)合物的成員。

關(guān)鍵詞：水稻；酵母雙雜交；種子發(fā)育；NAC

中圖分類號： S511.035.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0016-04

收稿日期：2014-05-07

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃（編號：2012BAD19B03）；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育專項(xiàng)（編號：2011ZX08010-005）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程。

作者簡介：唐立群（1987—），女，湖南東安人，碩士，從事水稻基因功能研究。E-mail：liquntang2013@126.com 。

通信作者：候雨萱，博士，助理研究員，從事水稻基因功能研究。E-mail：houyuxuan@caas.cn。真核生物中的大部分蛋白都是以復(fù)合物的形式存在并工作。一些蛋白在不同的生長發(fā)育時(shí)期通過與不同的蛋白互作，形成蛋白復(fù)合物來行使不同的生物學(xué)功能，從而保證生物體高效運(yùn)行。研究蛋白-蛋白之間的互作，進(jìn)而找出功能蛋白復(fù)合物的其他成員，一直是生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。目前，常用的研究蛋白-蛋白互作的方法有酵母雙雜交、免疫共沉淀、GST pull-down、雙分子熒光互補(bǔ)等技術(shù)，其中以酵母雙雜交方法應(yīng)用最為廣泛。 酵母雙雜交技術(shù)最早于1989年由Fields提出，其基本原理是酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4具有BD、AD 2個(gè)結(jié)構(gòu)域，BD與AD單獨(dú)作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但當(dāng)二者在空間上充分接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性并可激活UAS下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。因此，將要檢測互作的2個(gè)蛋白分別與BD、AD融合表達(dá)，當(dāng)這2個(gè)蛋白存在互作時(shí)，BD才能與AD在空間上靠近，進(jìn)而激活下游報(bào)告篩選基因的表達(dá)。相比其他蛋白互作檢測技術(shù)，酵母雙雜交具有眾多優(yōu)點(diǎn)：快速高效，無需提取或純化目標(biāo)蛋白質(zhì)；在酵母活體內(nèi)進(jìn)行，一定程度上代表了真核生物細(xì)胞的活體狀態(tài)；檢測的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱或暫時(shí)的相互作用。此外，通過構(gòu)建所需組織器官的酵母雙雜交篩選文庫，研究人員可以一次性篩選多個(gè)與“誘餌”互作的蛋白 。目前，已有大量的商業(yè)化酵母雙雜交系統(tǒng)試劑盒可供選擇，其中Clontech公司最新的Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System因具有高效、簡單、易操作的特點(diǎn)而被廣泛使用。這一體系運(yùn)用該公司特有的SMART cDNA合成技術(shù)在合成的cDNA兩端添加重組位點(diǎn)接頭，然后將合成的cDNA與線性化的載體共轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187中完成體內(nèi)重組，得到酵母雙雜交cDNA文庫。該體系的另一個(gè)特點(diǎn)是利用酵母不同菌株的交配（mating）技術(shù)來篩選文庫，操作簡單易行。Kanneganti等在研究水稻基因家族與脅迫相關(guān)的蛋白基因OsiSAP8功能時(shí)，發(fā)現(xiàn)其功能由A20、AN1這2個(gè)鋅指域相互作用而對水稻生理功能進(jìn)行調(diào)控[1]。Menke等運(yùn)用酵母雙雜法研究煙草轉(zhuǎn)錄因子WRKY1功能，結(jié)果表明，其與煙草HR-like細(xì)胞的死亡密切相關(guān)[2]。崔紅軍等在研究玉米的根部基因功能時(shí)也提及了這一技術(shù)[3]。轉(zhuǎn)錄因子是一群能與基因5′端上游特定序列專一性結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。轉(zhuǎn)錄因子依據(jù)結(jié)構(gòu)域的保守性可區(qū)分為數(shù)百個(gè)不同的家族，在生物體的生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。NAM、ATAF、CUC （NAC）類轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的家族，其所有成員在N端都含有1個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在C端則各不相同[4-7]。目前，關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能研究已有大量報(bào)道[8-9]。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，番茄的SINAC4調(diào)控果實(shí)的成熟及類胡蘿卜素的沉積[10]。Hu等發(fā)現(xiàn)，SNAC1可以通過調(diào)控水稻保衛(wèi)細(xì)胞的閉合來提高植株的耐旱性，可能是干旱反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子[11]。過量表達(dá)SNAC1還能提升小麥、棉花的抗逆性[12]。水稻是我國主要的糧食作物，開展水稻基因功能研究，了解水稻內(nèi)部各個(gè)基因、基因與外界的互作關(guān)系，對于保障國家糧食安全意義重大。本研究利用改良的種子RNA提取方法得到高質(zhì)量的總RNA，采用Make Your Own“Mate & PlateTM” Library System建立來源于水稻種子的酵母雙雜交體系，成功篩選到1個(gè)種子中特異表達(dá)的NAC轉(zhuǎn)錄因子ONAC023的互作蛋白。

1材料與方法

1.1材料

水稻品種日本晴種植于中國水稻研究所試驗(yàn)田，取受精 5 d 的種子作為材料。酵母菌株Y187與Y2HGold以及載體pGBKT7、pGADT7-Rec、Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System、YeastmakerTM Yeast Transformation System 2均購自Clontech 公司。RNA提取試劑Trizol購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

取自然受精5 d的種子，采用SDS-Trizol法抽提總RNA，簡要步驟如下：將200 mg種子材料置于1.5 mL離心管中，加300 μL SDS RNA extraction buffer （50 mmol/L pH值為8.0 Tris-HCl，150 mmol/L LiCl，5 mmol/L EDTA，1% SDS），用塑料研磨棒磨成勻漿后，加入等體積苯酚 ∶氯仿（1 ∶1）混合液抽提，取上清加入1 mL Trizol抽提RNA?？俁NA樣品用 2 μL DNAaseI（寶生物大連工程有限公司）37 ℃處理 30 min 后熱滅活。用NanoDrop2000分光光度計(jì)測量RNA的 D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm值及濃度，電泳檢測RNA的質(zhì)量。RT-PCR所用cDNA的反轉(zhuǎn)錄方法參照ReverTra Ace qPCR RT 的試劑盒說明書[東洋紡（上海）生物科技有限公司]。

1.3酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建

取2 μg RNA為模板，參照Clontech試劑盒的要求，反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，LD-PCR擴(kuò)增雙鏈cDNA，并用CHROMASPINTM TE-400Column純化，去除小于400 bp的片段。將5 μg cDNA與3 μg pGADT7rec 載體參照YeastmakerTM Yeast Transformation System 2試劑盒的要求轉(zhuǎn)入酵母Y187菌株中。經(jīng)SD/-Leu平皿篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子，再用freezing medium 收集菌體，得到freezing medium 酵母懸浮液，將文庫的懸浮液分裝在2 mL無菌離心管中，置于-80 ℃冰箱中長期保存。

1.4文庫插入片段檢測

在上述SD/-Leu平板上隨機(jī)挑取30個(gè)單菌落，再用YPDA液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，最后采用改良的酵母菌落PCR方法檢測插入片段的大小分布，具體步驟如下：取200 μL酵母培養(yǎng)液，離心收集菌體后加入45 μL sorbitol buffer 及 5 μL Zymolyase （上海索萊寶生物科技有限公司），懸浮菌體后 37 ℃ 處理2 h，然后加入150 μL去離子水稀釋，95 ℃處理 20 min，再置于冰上冷卻5 min，取1 μL產(chǎn)物作為模板，用引物PGADf、PGADr進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測文庫插入片段的大?。ㄒ镄蛄蟹謩e為PGADf：5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′；PGADr：5′-GTGAACTTGCGGGGTTT TTCAGTATCTACGAT-3′），反應(yīng)體系為：1×KOD Fx buffer，05 mmol/L dNTP 2.5 μL，正反引物各0.1 μmol/L，KOD Fx enzyme 2 U，去離子水補(bǔ)足總體積至50 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，68 ℃延伸3 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5ONAC023/pGBKT7載體的構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化

以水稻種子cDNA為模板，用YONAC023f、YONAC023r引物擴(kuò)增出ONAC023的759 bp完整編碼序列（YONAC023f：5′-CGGAATTCATGGCGATGACACCGCAGCT-3′；YONAC02 3r：5′-CGGGATCCCTAGCCACCATGGTTTCTTT-3′），PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，連接克隆到pGBKT7載體上。將測序驗(yàn)證后的載體質(zhì)粒按YeastmakerTM Yeast Transformation System 2試劑盒的要求轉(zhuǎn)入到酵母Y2HGold菌株中，經(jīng)SD/-Trp篩選，采用“1.4”中所述酵母菌落PCR方法驗(yàn)證陽性克隆。

1.6酵母雙雜交文庫的篩選和互作蛋白基因的測定

參照Clontech公司MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System的說明書完成文庫和誘餌蛋白ONAC023/pGBKT7的交配，酵母雜合子懸浮在10 mL 0.5×YPDA培養(yǎng)基中，取 1 μL 懸浮液稀釋后涂在SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基中用于計(jì)算篩選效率，其余雜合子酵母菌全部涂在含250 ng/mL Aba的 SD/-Leu/-Trp 培養(yǎng)基上，對于初篩得到的陽性克隆重新轉(zhuǎn)移到含250 ng/mL Aba及40 μg/mL x-α-Gal的 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/ 培養(yǎng)基上進(jìn)一步篩選，能在 4 d 內(nèi)長出并顯藍(lán)色的單菌落即為互作的陽性克隆。采用“1.4”所述的酵母菌落PCR方法擴(kuò)增出互作蛋白的基因序列，純化后用T7引物測序即可得到基因序列。

2結(jié)果與分析

2.1來源于水稻種子cDNA文庫的構(gòu)建

采用SDS-Trizol抽提受精5 d的水稻種子總RNA，此法能有效去除淀粉、儲藏蛋白等雜質(zhì)，提高抽提RNA的質(zhì)量。由D260 nm/D280 nm=1.86、D260 nm/D230 nm=1.91可知，抽提的RNA質(zhì)量較好，沒有產(chǎn)生降解以及多聚糖的污染。圖1是總RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳，可見水稻種子的3條帶比較清晰，沒有出現(xiàn)擴(kuò)散、拖尾等降解情況，且28S條帶明顯比18S條帶亮，進(jìn)一步確定RNA質(zhì)量適合文庫的反轉(zhuǎn)錄要求。水稻種子總RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA，再以單鏈cDNA為模板合成雙鏈cDNA，再將此cDNA過Chromaspin TE-400Column柱子純化，除去雜質(zhì)、小片段cDNA。由圖2可知，純化前cDNA的一些小片段已被有效去除。將純化后的雙鏈cDNA與載體pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞中完成體內(nèi)同源重組。將1 μL轉(zhuǎn)化子分別稀釋10、100、1 000倍并涂在 SD/-Leu 平皿上，統(tǒng)計(jì)平板培養(yǎng)基上的酵母菌落數(shù)量（圖 3），結(jié)果表明，文庫的容量為1.1×106庫的容量，轉(zhuǎn)化結(jié)果較理想，可以滿足下一步酵母雙雜篩選的需要。為了檢測文庫插入片段的大小及重復(fù)性，筆者隨機(jī)挑取30個(gè)文庫轉(zhuǎn)化子，通過酵母菌落PCR反應(yīng)檢測文庫插入片段大小。電泳結(jié)果顯示，插入片段平均大小約750 bp（圖4）。

2.2ONAC023是一個(gè)種子特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子

通過對水稻140個(gè)NAC基因家族成員的公共表達(dá)譜數(shù)

據(jù)進(jìn)行分析，筆者發(fā)現(xiàn)了1個(gè)種子特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子ONAC023（圖5）位于水稻2號染色體上，基因座 LOC_Os02g12310 包含2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子，CDS全長 759 bp。NCBI上的conserved domain檢索顯示，12～143位氨基酸是一個(gè)保守的NAM結(jié)構(gòu)域。為了驗(yàn)證ONAC023的種子特異表達(dá)模式，筆者分別以愈傷、根、莖、葉、葉鞘、幼穗、受精3 d種子、受精7 d種子、受精15 d種子的cDNA為模板，進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增檢測其時(shí)空表達(dá)模式。如圖6所示，ONAC023僅在種子中表達(dá)，其中在受精3 d時(shí)表達(dá)量最高，在受精15 d的種子中最為微弱，在其他組織中并沒有檢測到擴(kuò)增信號。因此筆者認(rèn)為，ONAC023是一個(gè)種子特異表達(dá)的NAC類轉(zhuǎn)錄因子，這樣的表達(dá)模式也暗示著ONAC023可能在種子發(fā)育的早期行使重要功能。

2.3ONAC023互作蛋白的篩選

為了驗(yàn)證ONAC023是否存在自激活，將構(gòu)建好的BD-ONAC023與pGADT7空載體轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold菌株中。結(jié)果顯示，BD-ONAC023與pGADT7成功共轉(zhuǎn)化的菌落并不能在含有Aba（250ng/mL）的QDO培養(yǎng)基上存活，表面ONAC023不存在自激活特性。采用酵母交配（mating）的篩選策略，筆者將表達(dá)BD-ONAC023誘餌蛋白的Y2HGold菌株以及包含種子cDNA文庫的Y187菌株混合培養(yǎng)24 h，再將酵母雜合子均勻涂布在SD/-Leu/-Trp/Aba（250 ng/mL）平皿上，進(jìn)行第1輪初篩選，初篩選共得到97個(gè)陽性單菌落。為驗(yàn)證初步篩選結(jié)果，每個(gè)陽性單菌落被挑到更高篩選壓的 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/Aba（250 ng/mL）/X-α-Gal平皿上進(jìn)行篩選，能夠在2 d內(nèi)長出顯藍(lán)色的菌落即被認(rèn)為是與ONAC023互作的陽性克隆，生長速度與藍(lán)色深淺則作為互作強(qiáng)度的判斷依據(jù)。第2輪高壓篩選排除61個(gè)假陽性克?。▓D7）。為了得到這些互作蛋白的基因序列，筆者采用酵母菌落PCR方法擴(kuò)增出cDNA片段。擴(kuò)增帶型一致的克隆被認(rèn)為是同一基因，只挑選其中1個(gè)，將PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序。經(jīng)Blast序列比對，最終篩選到21個(gè)與ONAC023互作的蛋白基因，具體基因ID及功能注釋如表1所示。這些互作的蛋白包括儲藏蛋白質(zhì)如谷蛋白、Cupin蛋白，具有分子伴侶功能的異構(gòu)酶peptidyl-prolyl cis-trans isomersae以及一些與代謝相關(guān)的酶類，如烯醇酶Enolase、乙醇脫氫酶等。

3結(jié)論與討論

高質(zhì)量的RNA是構(gòu)建cDNA文庫的第一步，直接影響文庫構(gòu)建的質(zhì)量。因發(fā)育的種子中含有大量的淀粉及儲藏蛋白質(zhì)，采用常規(guī)的Trizol法分離得到的RNA往往含有大量的多糖及蛋白成分，多糖與RNA被乙醇共沉淀后影響RNA的溶解及后續(xù)的克隆操作。本研究采用改良的SDS-Trizol法，利用SDS和酚仿混合物多次抽提，去除大量的淀粉、蛋白污染，然后再沿用傳統(tǒng)的Trizol法提取得到純凈的RNA，可以用于各種分子克隆操作。作為廣泛使用的蛋白-蛋白互作研究方法，酵母雙雜交是一項(xiàng)常規(guī)性的操作[13-14]。本研究在商業(yè)化

試劑盒的基礎(chǔ)上，對操作程序進(jìn)行了優(yōu)化。對于陽性克隆的基因序列進(jìn)行測定，商品化試劑盒推薦的是從陽性雜合子菌落中提取質(zhì)粒，然而因其拷貝數(shù)低、酵母破壁困難等因素，從酵母中一般只能得到微量的質(zhì)粒，無法滿足測序所需。因此，要將酵母中提取到的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中繁殖，以期得到測序所需的模板量，這一操作流程需要4～5 d，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究重新設(shè)計(jì)了特異的載體多克隆位點(diǎn)兩段的引物序列，利用改良的酵母菌落PCR方法，以陽性克隆的酵母菌落為模板，直接擴(kuò)增出基因序列，PCR產(chǎn)物純化后直接用T7引物測序即可，一般在12 h內(nèi)可以完成全部擴(kuò)增及純化流程，大大提高了效率。在酵母菌落PCR操作過程中，發(fā)現(xiàn)某些傳統(tǒng)的酵母破壁方法如沸水加熱破壁、SDS破壁以及單純的破壁酶都不具備良好的重復(fù)性。破壁酶結(jié)合加熱破壁可以有效破除酵母細(xì)胞壁，確保質(zhì)粒釋放到溶液中。本研究還將破壁后的反應(yīng)液稀釋數(shù)倍以減少酵母破壁后一些次生代謝物的影響。RT-PCR結(jié)果顯示，ONAC023在種子中特異表達(dá)，且在種子發(fā)育的早期表達(dá)量要高于后期。通過對水稻早期種子的cDNA酵母雙雜交文庫進(jìn)行篩選，本研究尋找到21個(gè)可能與ONAC023互作的蛋白，包括儲藏蛋白質(zhì)如谷蛋白、Cupin蛋白，分子伴侶以及一些與代謝相關(guān)的酶類，其中1個(gè)DNA binding蛋白（LOC_Os05g01050）與ONAC023有強(qiáng)烈互作。LOC_Os05g01050編碼1個(gè)含有135個(gè)氨基酸的蛋白，其中 46～106 位氨基酸是一個(gè)保守的DNA binding結(jié)構(gòu)域，可能具有轉(zhuǎn)錄因子的特性。已有大量報(bào)道顯示，轉(zhuǎn)錄因子一般都是通過與多個(gè)蛋白形成復(fù)合物來啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄，如 NF-Y 類轉(zhuǎn)錄因子就是與其他2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子以異源三聚體復(fù)合物的形態(tài)工作[15]。因此，我們推測LOC_Os05g01050可能是ONAC023蛋白復(fù)合物的成員。公共表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，LOC_Os05g01050是一個(gè)組成型表達(dá)的基因，其功能尚無報(bào)道。本研究結(jié)果為研究ONAC023在種子發(fā)育中的功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，尤其是具有轉(zhuǎn)錄因子特性的DNA binding蛋白LOC_Os05g01050將是研究的重點(diǎn)。但考慮到酵母雙雜交結(jié)果存在假陽性的缺點(diǎn)，仍需要其他獨(dú)立的蛋白-蛋白互作技術(shù)，如免疫共沉淀或GST pull down等來進(jìn)一步驗(yàn)證這些互作結(jié)果。

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