Th17細(xì)胞表達(dá)在丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病機(jī)制中的作用研究

康輝+羅麗娟+蔡素芬+鄒崢

[摘要] 目的 探討Th17細(xì)胞在兒童丙種球蛋白耐藥性川崎病發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法 選擇2013年5月～2014年5月本院診斷為川崎病的患兒100例作為研究對(duì)象，根據(jù)是否存在耐藥性分為丙種球蛋白耐藥組和非丙種球蛋白耐藥組，選擇30例正常兒童作為健康對(duì)照組，收集研究對(duì)象外周血4～5 ml，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞，采用熒光定量PCR檢測IL-23P19與RORrt基因mRNA表達(dá)量。 結(jié)果 丙種球蛋白耐藥組外周血PBMC中Th17細(xì)胞占CD4+細(xì)胞百分率明顯高于非丙種球蛋白耐藥組、健康對(duì)照組，且非丙種球蛋白耐藥組高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；丙種球蛋白耐藥組及非丙種球蛋白耐藥組RORrt基因表達(dá)量高于健康對(duì)照組（P<0.05）；非丙種球蛋白耐藥組IL-23P19基因mRNA表達(dá)量與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 Th17細(xì)胞表達(dá)與丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病具有相關(guān)性，這為丙種球蛋白耐藥型川崎病的診治及預(yù)后提供新的研究途徑，有利于減少川崎病患兒心血管損傷的后遺癥，保護(hù)兒童身心健康，具有較大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

[關(guān)鍵詞] 輔助性T淋巴細(xì)胞17；丙種球蛋白耐藥型川崎病；發(fā)病機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R54 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）10（a）-0024-03

川崎病是一種病因不明的以全身中、小血管炎為主要病變的兒童急性發(fā)熱出疹性疾病，可導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈損害[1]。大劑量丙種球蛋白聯(lián)合阿司匹林是公認(rèn)的有效方法，但仍有10%～20%患兒對(duì)丙種球蛋白耐藥，其冠狀動(dòng)脈損害發(fā)生率達(dá)48.6%[2]。治療前就可前瞻性地判斷丙種球蛋白的有效性，在緩解患者病情、減少各種并發(fā)癥方面具有重大意義。目前，在國內(nèi)外報(bào)道Th17細(xì)胞表達(dá)川崎病發(fā)病機(jī)制中作用研究方面基本很少，而Th17細(xì)胞表達(dá)在丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病機(jī)制中的作用方面的報(bào)道更是少數(shù)。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)及熒光定量PCR對(duì)丙種球蛋白耐藥型川崎病患者的Th17細(xì)胞進(jìn)行檢測，從細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域系統(tǒng)全面地探討Th17細(xì)胞表達(dá)與丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病的相關(guān)性，為丙種球蛋白耐藥型川崎病的治療及預(yù)后提供新的研究途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年5月～2014年5月在本院診斷為川崎病的患兒100例作為研究對(duì)象，根據(jù)是否存在耐藥性分為丙種球蛋白耐藥組和非丙種球蛋白耐藥組，另選擇30例正常兒童作為健康對(duì)照組。非丙種球蛋白耐藥組共80例，年齡5個(gè)月～6歲，男性56例，女性24例；丙種球蛋白耐藥組20例，年齡6個(gè)月～6歲，男性14例，女性6例；健康對(duì)照組30例，年齡7個(gè)月～6.4歲，男性16例，女性14例。3組的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。受試者家屬對(duì)實(shí)驗(yàn)已知情，并且簽字同意。

1.2 研究方法

采研究對(duì)象靜脈血4～5 ml，抗凝（EDTA），采取Ficoll密度梯度離心進(jìn)行分離并提取患兒的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。流式細(xì)胞術(shù)來檢測各組患兒的Th17細(xì)胞水平：調(diào)整PBMC細(xì)胞濃度為2×106/ml，1 ml 1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清）于24孔板內(nèi)培養(yǎng)。其中加入PMA：50 ng/ml，Ionomycin：750 ng/ml，高爾基阻斷劑1 μl在溫度為37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～6 h，收集細(xì)胞到EP管內(nèi)，1500 r/min離心5 min，去上清，暗室內(nèi)用單抗抗人-CD3-PECy5，CD8-FITC室溫孵育20 min，表面染色后固定、破膜，用抗人-IL-17A-PE胞內(nèi)染色檢測Th17細(xì)胞的比例。Th17的檢測以相應(yīng)的同型IgG染色細(xì)胞作為陰性對(duì)照。采用熒光定量PCR檢測IL-23P19與RORrt基因mRNA表達(dá)，RORrt基因序列為F：5′-TCAGTCATGAGAACACAAATTGA-3′，R：5′GCACCCCTCACAGGTGATAA-3′；IL-23P19為F：5-′GGGAGATGAAGAGACTACAAATGATGT-3′，R：5′-CATATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTG-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組外周血PBMCs中Th17細(xì)胞占CD4+細(xì)胞百分率的比較

丙種球蛋白耐藥組外周血PBMC中Th17細(xì)胞占CD4+百分率為（1.286±0.616）%，明顯高于非丙種球蛋白耐藥組的（0.913±0.469）%及健康對(duì)照組的（0.549±0.416）%，且非丙種球蛋白耐藥組外周血PBMC中Th17細(xì)胞占CD4+百分率高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

與丙種球蛋白耐藥組比較，*P<0.05；與健康對(duì)照組比較，#P<0.05

2.2 3組IL-23P19與RORrt基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

丙種球蛋白耐藥組RORrt基因mRNA相對(duì)表達(dá)量高于非丙種球蛋白耐藥組及健康對(duì)照組，且非丙種球蛋白耐藥組高于健康對(duì)照組（P<0.05）；丙種球蛋白耐藥組IL-23P19基因mRNA相對(duì)表達(dá)量高于非丙種球蛋白耐藥組及健康對(duì)照組（P<0.05），但非丙種球蛋白耐藥組與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3 討論

1967年在日本，川崎教授首次完整地描述并報(bào)道了川崎病，目前因?yàn)閷?duì)川崎病的認(rèn)識(shí)加深且常可以及時(shí)地治愈鏈球菌感染等各種因素，川崎病的發(fā)病率已超越了兒童風(fēng)濕熱。相關(guān)資料表明，全球川崎病平均發(fā)病率是3.4/10萬～100/10萬，尤以日本最高，日本5歲以下的兒童其發(fā)病率達(dá)到驚人的100/10萬，而在北美洲的美國僅僅是10/10萬。男女發(fā)病比例是1.3∶1.7[3-5]。發(fā)病無明顯季節(jié)差異。川崎病最主要的并發(fā)癥為冠狀動(dòng)脈損傷。通過使用大劑量的丙種球蛋白（IVIG），冠狀動(dòng)脈病變的發(fā)生率可有效降低，然而在一些發(fā)達(dá)國家，并發(fā)癥冠狀動(dòng)脈病變已成為一種最常見的小兒獲得性心臟病。在出現(xiàn)川崎病急性期后，會(huì)持續(xù)地存在冠狀動(dòng)脈損害，這是導(dǎo)致患兒死亡的一個(gè)主要原因[6-7]，本研究結(jié)果顯示，川崎病患者外周血Th17細(xì)胞占CD4+細(xì)胞百分率明顯高于健康對(duì)照組（P<0.05），可認(rèn)為Th17細(xì)胞在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中占主要作用；Th17細(xì)胞及IL-23P19與RORrt在丙種球蛋白耐藥型川崎病患者中的表達(dá)量比非丙種球蛋白耐藥型川崎病及健康對(duì)照組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），可認(rèn)為增高的Th17可誘發(fā)各種炎癥因子釋放，促進(jìn)丙種球蛋白耐藥型川崎病的血管損傷和炎癥反應(yīng)。

近年來已發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞和Th1、Th2不同，能產(chǎn)生IL-17功能的又一群CD4+輔助性T細(xì)胞，能參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與自身免疫性疾病、參與移植排斥反應(yīng)及腫瘤免疫，其在多種自身免疫性疾病、急慢性炎癥的調(diào)節(jié)軸中占有最中心地位[8-11]，如多發(fā)性硬化、炎性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。Th17分泌的物質(zhì)主要有IL-17A、IL-22、IL-17F等，其中IL-17A具備強(qiáng)促炎作用，能與IL-17受體相結(jié)合，促進(jìn)MCP-1、TNF-α、CCX、MIP-2等各種趨化因子、MMP的表達(dá)，能有效趨化單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞至炎癥部位，能介導(dǎo)組織滲透及損傷，還能刺激前列腺素E2、IL-6的產(chǎn)生及損傷內(nèi)皮細(xì)胞[6]。同時(shí)，其還可以與IL-1β、TNF-α等其他炎癥因子協(xié)同作用而發(fā)揮增效作用，造成炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步加重。Th17細(xì)胞會(huì)通過分泌IL-17而作用不同的靶點(diǎn)細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生其他各種細(xì)胞因子，參與細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，觸發(fā)釋放炎癥遞質(zhì)，進(jìn)而有效地發(fā)揮生物效應(yīng)，表明Th17細(xì)胞確實(shí)在川崎病發(fā)病中參與作用，而其在丙種球蛋白耐藥型川崎病中的作用目前仍不甚清楚。

本研究進(jìn)一步通過檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病患兒Th17細(xì)胞、IL-23P19與RORrt的變化旨在進(jìn)一步探討Th17、IL-23P19與RORrt在檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病的免疫發(fā)病機(jī)制中的意義，從細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域系統(tǒng)全面地探討Th17、IL-23P19與RORrt細(xì)胞表達(dá)與丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病的相關(guān)性，為丙種球蛋白耐藥型川崎病的診治及預(yù)后提供理論依據(jù)，從而減少川崎病患兒冠狀動(dòng)脈損害及心臟損害的后遺癥，保護(hù)兒童身心健康。

[參考文獻(xiàn)]

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[4] 陳婧，馬彬，林麗星，等.不同劑量丙種球蛋白治療川崎病的療效的Meta分析[J].中國當(dāng)代兒科雜志，2011，13（8）：638-643.

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[9] 王從軍，陳梅，雷中勁，等.川崎病患兒細(xì)胞免疫功能狀況及轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3的調(diào)控作用[J].中國病理生理雜志，2014，30（4）：733-737.

[10] 晏萍蘭，李萍.靜脈注射丙種球蛋白治療小兒川崎病不良反應(yīng)觀察與護(hù)理[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（8）：1366-1368.

[11] 王國兵，溫鵬強(qiáng)，王勤，等.急性期川崎病患兒調(diào)節(jié)性B細(xì)胞改變及意義初探[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2013，33（10）：750-755.

（收稿日期：2014-06-30 本文編輯：李亞聰）

近年來已發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞和Th1、Th2不同，能產(chǎn)生IL-17功能的又一群CD4+輔助性T細(xì)胞，能參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與自身免疫性疾病、參與移植排斥反應(yīng)及腫瘤免疫，其在多種自身免疫性疾病、急慢性炎癥的調(diào)節(jié)軸中占有最中心地位[8-11]，如多發(fā)性硬化、炎性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。Th17分泌的物質(zhì)主要有IL-17A、IL-22、IL-17F等，其中IL-17A具備強(qiáng)促炎作用，能與IL-17受體相結(jié)合，促進(jìn)MCP-1、TNF-α、CCX、MIP-2等各種趨化因子、MMP的表達(dá)，能有效趨化單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞至炎癥部位，能介導(dǎo)組織滲透及損傷，還能刺激前列腺素E2、IL-6的產(chǎn)生及損傷內(nèi)皮細(xì)胞[6]。同時(shí)，其還可以與IL-1β、TNF-α等其他炎癥因子協(xié)同作用而發(fā)揮增效作用，造成炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步加重。Th17細(xì)胞會(huì)通過分泌IL-17而作用不同的靶點(diǎn)細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生其他各種細(xì)胞因子，參與細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，觸發(fā)釋放炎癥遞質(zhì)，進(jìn)而有效地發(fā)揮生物效應(yīng)，表明Th17細(xì)胞確實(shí)在川崎病發(fā)病中參與作用，而其在丙種球蛋白耐藥型川崎病中的作用目前仍不甚清楚。

本研究進(jìn)一步通過檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病患兒Th17細(xì)胞、IL-23P19與RORrt的變化旨在進(jìn)一步探討Th17、IL-23P19與RORrt在檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病的免疫發(fā)病機(jī)制中的意義，從細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域系統(tǒng)全面地探討Th17、IL-23P19與RORrt細(xì)胞表達(dá)與丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病的相關(guān)性，為丙種球蛋白耐藥型川崎病的診治及預(yù)后提供理論依據(jù)，從而減少川崎病患兒冠狀動(dòng)脈損害及心臟損害的后遺癥，保護(hù)兒童身心健康。

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[4] 陳婧，馬彬，林麗星，等.不同劑量丙種球蛋白治療川崎病的療效的Meta分析[J].中國當(dāng)代兒科雜志，2011，13（8）：638-643.

[5] 樸金花，金蓮花，孫景輝，等.大劑量靜脈注射丙種球蛋白無反應(yīng)性川崎病的臨床分析[J].臨床兒科雜志，2009，27（5）：480-483.

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[10] 晏萍蘭，李萍.靜脈注射丙種球蛋白治療小兒川崎病不良反應(yīng)觀察與護(hù)理[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（8）：1366-1368.

[11] 王國兵，溫鵬強(qiáng)，王勤，等.急性期川崎病患兒調(diào)節(jié)性B細(xì)胞改變及意義初探[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2013，33（10）：750-755.

（收稿日期：2014-06-30 本文編輯：李亞聰）

近年來已發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞和Th1、Th2不同，能產(chǎn)生IL-17功能的又一群CD4+輔助性T細(xì)胞，能參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與自身免疫性疾病、參與移植排斥反應(yīng)及腫瘤免疫，其在多種自身免疫性疾病、急慢性炎癥的調(diào)節(jié)軸中占有最中心地位[8-11]，如多發(fā)性硬化、炎性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。Th17分泌的物質(zhì)主要有IL-17A、IL-22、IL-17F等，其中IL-17A具備強(qiáng)促炎作用，能與IL-17受體相結(jié)合，促進(jìn)MCP-1、TNF-α、CCX、MIP-2等各種趨化因子、MMP的表達(dá)，能有效趨化單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞至炎癥部位，能介導(dǎo)組織滲透及損傷，還能刺激前列腺素E2、IL-6的產(chǎn)生及損傷內(nèi)皮細(xì)胞[6]。同時(shí)，其還可以與IL-1β、TNF-α等其他炎癥因子協(xié)同作用而發(fā)揮增效作用，造成炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步加重。Th17細(xì)胞會(huì)通過分泌IL-17而作用不同的靶點(diǎn)細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生其他各種細(xì)胞因子，參與細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，觸發(fā)釋放炎癥遞質(zhì)，進(jìn)而有效地發(fā)揮生物效應(yīng)，表明Th17細(xì)胞確實(shí)在川崎病發(fā)病中參與作用，而其在丙種球蛋白耐藥型川崎病中的作用目前仍不甚清楚。

本研究進(jìn)一步通過檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病患兒Th17細(xì)胞、IL-23P19與RORrt的變化旨在進(jìn)一步探討Th17、IL-23P19與RORrt在檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病的免疫發(fā)病機(jī)制中的意義，從細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域系統(tǒng)全面地探討Th17、IL-23P19與RORrt細(xì)胞表達(dá)與丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病的相關(guān)性，為丙種球蛋白耐藥型川崎病的診治及預(yù)后提供理論依據(jù)，從而減少川崎病患兒冠狀動(dòng)脈損害及心臟損害的后遺癥，保護(hù)兒童身心健康。

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[6] 張慶，李曉靜.川崎病的治療現(xiàn)狀[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2010，31（5）：766-769.

[7] 丁艷，尹薇，熊越華，等.川崎病患兒免疫功能的檢測及臨床價(jià)值[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2012，16（9）：588-592.

[8] 韓云坤，孫冰，李麗紅，等.川崎病T細(xì)胞免疫及細(xì)胞因子變化的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15（9）：1533-1536.

[9] 王從軍，陳梅，雷中勁，等.川崎病患兒細(xì)胞免疫功能狀況及轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3的調(diào)控作用[J].中國病理生理雜志，2014，30（4）：733-737.

[10] 晏萍蘭，李萍.靜脈注射丙種球蛋白治療小兒川崎病不良反應(yīng)觀察與護(hù)理[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（8）：1366-1368.

[11] 王國兵，溫鵬強(qiáng)，王勤，等.急性期川崎病患兒調(diào)節(jié)性B細(xì)胞改變及意義初探[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2013，33（10）：750-755.

（收稿日期：2014-06-30 本文編輯：李亞聰）