楊建課，宮 磊，高繼光，林愛琴，徐思斌

2.皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室；

Email：ajiankebc＠126.com

A型禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬，在全世界范圍內(nèi)的家禽、野鳥、哺乳動物及人類中廣泛傳播[1]。該病毒基因組擁有8條負(fù)RNA鏈，至少編碼11種不同功能的蛋白質(zhì)。依據(jù)其表面血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性，將其分成16個HA亞型和9個NA亞型，最近又在一些蝙蝠體內(nèi)分離并鑒定出了新的H17N10亞型[2]。這些病毒對人類的生活和健康都構(gòu)成了極大的威脅。

雖然人們早已分離出低致病性禽流感病毒（LPAI）H6N1，且研究表明其在一定條件下具有在人和哺乳動物間交叉感染的能力[3－4]，但很少見到人感染的病例。2013年6月，臺灣發(fā)現(xiàn)了首例人感染H6N1禽流感病例[5－7]，引人關(guān)注。特擬對人感染H6N1禽流感病毒的HA基因及其近緣序列的分子特征及進(jìn)化分析，以探求其變異規(guī)律、致病機(jī)制、來源及進(jìn)化情況，為禽流感病毒的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 通過Blast方法從美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）流感病毒資源庫（Flu）和全球禽流感基因共享數(shù)據(jù)庫（GISAID）中獲得人感染H6N1禽流感病毒HA基因及近緣序列共47條，其中42條來自臺灣（如表1）。經(jīng) MAFFT version 7.110比對和BioEdit version 7.2.1人工校正后作為分析數(shù)據(jù)集。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹重建 分別采用最大似然法（ML）、最大簡約法（MP）、貝葉斯推理法（BI），以A／CK／TW／G23／87（DQ376692）為外類群，jModelTest version 2.1.4的AIC標(biāo)準(zhǔn)計算的GTR＋G為最適模型，重建其系統(tǒng)發(fā)育樹。其中ML、MP樹分別在軟件 PhyML3.0、PAUP version 4.0b10中運(yùn)算執(zhí)行，自舉檢驗(yàn)值（Bootstrap）1 000次重復(fù)檢驗(yàn)；BI樹由MrBayes 3.2運(yùn)算獲得，4個獨(dú)立的馬可夫鏈－蒙特卡羅（MCMC）數(shù)據(jù)模擬技術(shù)運(yùn)算1百萬代，每100代取樣一次，舍棄前2 500個老化樣本（burnin）后，其余樣本用來推測后驗(yàn)概率。

1.3 分子特征分析 分別通過NetNGlyc 1.0、NetOglyc 4.0預(yù)測氨基酸序列的N－糖基化位點(diǎn)和O－糖基化位點(diǎn)。以人感染H6N1禽流感病毒的HA蛋白序列為參考，分析其變異位點(diǎn)和裂解位點(diǎn)的特征，并通過 ProtParam、DiANNA 1.1、SignalP 4.1分別預(yù)測其理化性質(zhì)、二硫鍵和信號肽的位置。

1.4 進(jìn)化速率和分歧時間推斷 采用GTR＋G模型、貝葉斯輪廓式（Bayesian Skyline）種群增長模式和對數(shù)正態(tài)分布松弛分子鐘模型（CoV＞0），通過BEAST v1.7.5推測42條臺灣數(shù)據(jù)的進(jìn)化速率（位點(diǎn)／年）和最近共同祖先（TMRCA）時間。2個獨(dú)立的MCMC數(shù)據(jù)模擬技術(shù)運(yùn)算5千萬代。FigTree v1.4.0顯示樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和相關(guān)信息。

2 結(jié) 果

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析 為更準(zhǔn)確分析人感染H6N1禽流感病毒HA基因的來源和進(jìn)化歷程，我們分別構(gòu)建了ML、MP和BI樹，三種樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，僅支持率略有不同（如圖1）。根據(jù)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、支持率、病毒出現(xiàn)的時間、地點(diǎn)和序列特征等分析，由A／CK／TW／G23／87進(jìn)化而來的46株病毒聚為兩支。支1所含毒株均來自臺灣，支持率 ML／MP／BI分別為99／99／1，其內(nèi)部進(jìn)一步聚成三個亞支，其中支1.3支持率為99／99／1，包括 A／CK／TW／PF3／02及1999至2004年間分離的11株病毒；支1.2支持率為100／100／1，共4株病毒，其中人感染 H6N1禽流感病毒（A／TW／2／13）與A／CK／TW／A2837／13親緣關(guān)系最近，互為姐妹支，再與2004和2005年的兩株禽感染病毒聚在一起；支1.1的支持率為85／86／0.96，含有2001至2010年間分離的20株病毒，毒株數(shù)最多。支1.1和1.2互為姐妹 支，再 與 A／CK／TW／1205／01 和 A／CK／TW／0329／01聚在一起，支持率分別為88／86／0.88和100／100／1。支2支持率為81／76／1，含5株來自廣西和荷蘭的禽流感病毒，寄主全為水禽，距根部最近。

2.2 HA蛋白的分子特征 人感染H6N1病毒的HA蛋白的分子量約為63.6KDa，等電點(diǎn)為6.07，由567個氨基酸殘基組成，其中亮氨酸（L）含量最高（8.3%），組氨酸（H）最少（1.6%）。1至16位為信號肽序列，引導(dǎo)新合成的HA蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。序列共有15個半胱氨酸（C），可形成7個二硫鍵（6與92、44與479、57與137、279與552、283與468、307與475、542與549）；含有5個 N－糖基化位點(diǎn)（第13、25、169、293、544位）和2個 O－糖基化位點(diǎn)（第130、134位）（如表1），其中N－糖基化位點(diǎn)在不同支系間較為保守，O－糖基化位點(diǎn)變異較大（支2多為一個、支1.3多為三個，支1.1和1.2多為兩個）。HA1和HA2的裂解位點(diǎn)位于第331和332位間，其上游序列PQIATR，較為保守，僅含有一個堿性氨基酸，其中裂解位點(diǎn)上游第三位氨基酸（即329位）變異較大，較早分離的幾株病毒為賴氨酸（K），而支1.2的4株病毒為特有的丙氨酸（A），其余毒株為谷氨酸（E）。雖然人感染H6N1禽流感病毒的HA蛋白序列第193N、226Q、228S與其它禽感染病毒一致，但P186L、A287T為其所特有。此外，55K、100L、157D、160T、200K、238R、480M、495K為毒株 A／TW／2／13和 A／CK／TW／A2837／13特有，86N、273D、329A為支1.2所特有。

2.3 進(jìn)化速率和TMRCA時間推測對來自臺灣的42條HA基因進(jìn)行了進(jìn)化速率（位點(diǎn)／年）和TMRCA推測，結(jié)果如表2。節(jié)點(diǎn)C進(jìn)化速率最大，為5.99×10－3位點(diǎn)／年，說明支1.2的進(jìn)化速速最快；節(jié)點(diǎn)F次之，為5.90×10－3位點(diǎn)／年；而節(jié)點(diǎn)B進(jìn)化速率最小，為4.40×10－3位點(diǎn)／年，說明支1.3進(jìn)化的最慢。節(jié)點(diǎn)D所代表的最近共同祖先時間為2012年，故推測人感染H6N1禽流感病毒的HA基因于2012年早期由家禽的序列進(jìn)化而來。此外，C、D節(jié)點(diǎn)間枝長較長，TMRCA相差10年之久。

表1 人感染H6N1及近緣禽流感病毒HA基因的登錄號及糖基化位點(diǎn)（參考H3序列位置）Tab.1 Accession numbers and glycosylation sites of the HA gene from human－infecting H6N1and allied avian influenza virus（H3 numbering）

表2 不同節(jié)點(diǎn)的進(jìn)化速率（位點(diǎn)／年）和最近共同祖先（TMRCA）時間Tab.2 Substitution rates（sites／year）and the most recent common ancestor（TMRCA）of some significant nodes

圖1 人感染H6N1及近緣禽流感病毒HA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。支上數(shù)字分別表示 ML、MP、BI樹的支持率，大寫的英文字母代表一些重要的節(jié)點(diǎn)，加粗?jǐn)?shù)字表示不同的支。Fig.1 Phylogenetic trees of the HA genes from human－infecting H6N1and allied avian influenza virus by maximum likelihood（ML），maximum parsimony（MP）and Bayesian inference（BI）

3 討 論

雖然相對于高致病性的H7N9[8]，低致病性的H6N1對人的危害性較小，但其對家禽的孵化率、死亡率及產(chǎn)蛋量等影響很大[4]，且可能與其它禽流感病毒重配產(chǎn)生新型高致病性流感病毒，如A／Hong Kong／156／97（H5N1）的產(chǎn)生[9]，應(yīng)高度關(guān)注。截止目前，由 A／CK／TW／G23／87進(jìn)化而來的 H6亞型至少有2種類型——支1和2，支2病毒主要出現(xiàn)在歐洲和中國的南部，支1病毒全分布在臺灣。其中亞支1.3所含病毒出現(xiàn)時間相對較早，進(jìn)化速率小，可能已不是優(yōu)勢種群，甚至已完全消失。而亞支1.1、1.2病毒可能為當(dāng)?shù)貎?yōu)勢種群，正在流行且進(jìn)化速度快，說明其還在不斷的進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境。人感染H6N1禽流感病毒HA基因?qū)儆趤喼?.2，高的支持率和一些特有的氨基酸位點(diǎn)，都表明這是早在2002年就進(jìn)化出的新類型，并已適應(yīng)外部環(huán)境。然而目前分離的毒株并不多，可能因?yàn)槠涞椭虏⌒?，很多毒株未被發(fā)現(xiàn)，節(jié)點(diǎn)C、D間的長枝也說明如此[7]。Wei等[6]研究認(rèn)為，人感染H6N1禽流感病毒HA基因可能由A／CK／TW／PF3／02，經(jīng)A／CK／TW／0204／05進(jìn)化而來，而我們的結(jié)果不完全支持此觀點(diǎn)。支1.1和1.2先與A／CK／TW／1205／01、A／CK／TW／0329／01聚在一起后再與A／CK／TW／PF3／02所在的支1.3互為姐妹支，結(jié)合有關(guān)數(shù)據(jù)[5，7，10]可見：人感染H6N1禽流感病毒HA基因最早由A／CK／TW／G23／87，經(jīng)A／CK／TW／0824／97、A／CK／TW／1205／01、A／CK／TW／0204／05，直到2012年由家禽的序列進(jìn)化而產(chǎn)生，與A／CK／TW／PF3／02（H6N1）病毒為共進(jìn)化關(guān)系。

HA蛋白以同源三聚體的形式鑲嵌在病毒表面，作為主要的表面抗原，與病毒復(fù)制、毒力及宿主特異性等密切相關(guān)。研究表明，裂解位點(diǎn)上游堿性氨基酸的數(shù)目決定著HA蛋白能否被裂解成HA1和HA2，進(jìn)而影響病毒的復(fù)制和毒力[11－12]。人感染H6N1禽流感病毒HA蛋白的裂解位點(diǎn)上游6個氨基酸里僅有1個堿性氨基酸，表明其仍是低致病性的[6－7]，但位點(diǎn)328、329（裂解位點(diǎn)上游第4、第3位）具有很大的變異性，可見其受到很大的選擇壓力，將來有可能進(jìn)化產(chǎn)生高致病性的人感染H6亞型流感病毒。前人研究還表明HA蛋白的第226位（參照H3序列）如為Q，則特異性地與禽類含唾液酸α－2，3半乳糖的糖蛋白受體結(jié)合；如為L，則特異性地與人類含唾液酸α－2，6半乳糖的糖蛋白受體結(jié)合；此外，193R、228G、糖基化位點(diǎn)等也與宿主的特異性有關(guān)[11，13－14]。人感染H6N1禽流感病毒H蛋白193N、226Q、228S未表現(xiàn)出人感染型的特性，可能尚未來得及進(jìn)化，但特有的P186L也許是其感染人的原因[7，13]。同時，特有的A287T在病毒宿主的選擇上是否具有一定作用，目前還不清楚。該蛋白擁有5個N－糖基化位點(diǎn)，其中4個位于HA1區(qū)，1個位于HA2區(qū)，5個位點(diǎn)都比較保守，表明其具有重要的生物學(xué)功能[15]。同時擁有2個O－糖基化位點(diǎn)，具體功能未知，但在不同類群間有所變異，這可能是適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果。

綜上，人感染H6N1禽流感病毒的HA基因由家禽的進(jìn)化而來，并具備了感染人的能力，由于其高的進(jìn)化速率和病毒重配的可能性，加以時日有可能進(jìn)化出新型高致病性的H6亞型，人們應(yīng)高度重視，并能及時的給與監(jiān)測和防治。

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