韋小瑜，田克誠(chéng)，游 旅，唐光鵬，王定明

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彎曲菌是重要的食源性人獸共患病原菌，可引起人類急性腸炎，并可并發(fā)格林巴利綜合征、菌血癥、活動(dòng)性關(guān)節(jié)炎等多種疾病[1]。本文從1例新生兒剝脫性皮炎患者的血液中分離出疑似空腸彎曲菌，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、系統(tǒng)生化和分子生物學(xué)鑒定。

1 材料與方法

1.1 病例 患者為出生11d的女嬰，家住貴州省仁懷市九倉(cāng)鎮(zhèn)，家中生產(chǎn)?；純撼錾?d時(shí)出現(xiàn)口周皮膚潮紅，漸發(fā)展為全身皮膚潮紅，面部、四肢、腹部皮膚部分剝脫等癥狀體征，遂入住遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，診斷為“新生兒剝脫性皮炎，顱內(nèi)感染？鵝口瘡”。其住院期間最高體溫40.6。C（肛溫），伴四肢抽搐，反應(yīng)差。實(shí)驗(yàn)室檢查：WBC13.87×109／L，中性淋巴細(xì)胞比例56%，淋巴細(xì)胞比例31%，單核細(xì)胞比例12%；肝功能ALT54U／L，AST68U／L，總膽紅素92.1umol／L，直接膽紅素20umol／L，肌酸激酶359U／L，乳酸脫氫酶572U／L。該醫(yī)院采用血培養(yǎng)法從患者血液中分離到病原菌，經(jīng)細(xì)菌鑒定儀鑒定為“弗朗西斯菌”，并將菌株送至本室鑒定。

1.2 主要試劑和儀器 哥侖比亞血瓊脂基礎(chǔ)購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，脫纖維羊血購(gòu)自北京友康基業(yè)公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。微需氧培養(yǎng)箱為CB150（Binder，德國(guó)）；PCR 儀為德國(guó)80W－Tprofessional Gradient 96；凝膠成像儀為Gel Doc2000型（Bio－Rad，美國(guó)）；全自動(dòng)微生物鑒定儀為VITEK2.0（法國(guó)，梅里埃）。引物合成由大連寶生物公司完成。

1.3 試驗(yàn)菌和參考菌株 試驗(yàn)菌株分離自“新生兒剝脫性皮炎”患者血液的“弗朗西斯菌“疑似菌株，編號(hào)：GZ201201，參考菌株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供（CJ參考株）。

1.4 傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法鑒定空腸彎曲菌 按照 WS271－2007標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，試驗(yàn)內(nèi)容包括菌落培養(yǎng)條件、觀察菌落生長(zhǎng)時(shí)間、形態(tài)、菌落染色、氧化酶和觸酶試驗(yàn)等。

1.5 系統(tǒng)生化鑒定空腸彎曲菌 采用梅里埃VITEK2.0全自動(dòng)微生物鑒定儀，將試驗(yàn)菌和空腸彎曲菌參考菌株制成菌懸液后，上NH卡進(jìn)行微生物系統(tǒng)生化鑒定。

1.6 DNA提取 將試驗(yàn)菌和參考菌株接種至哥侖比亞血平板培養(yǎng)48h后，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒按照說(shuō)明書操作步驟提取細(xì)菌DNA。

1.7 多重PCR方法鑒定空腸彎曲菌 按照文獻(xiàn)[2]提供的16sRNA、mapA引物序列和參數(shù)對(duì)試驗(yàn)菌和參考菌株核酸進(jìn)行擴(kuò)增，以參考菌株核酸作為陽(yáng)性對(duì)照，超純水作為陰性對(duì)照。

1.8 NAP－mPCR方法鑒定空腸彎曲菌亞種 采用文獻(xiàn)[3]所述NAP－mPCR引物序列和參數(shù)對(duì)試驗(yàn)菌和參考菌株進(jìn)行空腸彎曲菌亞種的鑒定，引物序列見(jiàn)表1。

表1 NAP－mPCR用引物Tab.1 Primers used in NAP－mPCR

2 結(jié) 果

2.1 試驗(yàn)菌形態(tài)、染色及常規(guī)生化鑒定結(jié)果 試驗(yàn)菌轉(zhuǎn)種至哥侖比亞選擇性血平板，37。C普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，42。C微需氧培養(yǎng)箱（85%N2，10%CO2，5%O2）培養(yǎng)48h后，可見(jiàn)大小約0.5～1mm、圓形、邊緣整齊、無(wú)色透明、水滴狀、表面光滑濕潤(rùn)、不溶血的菌落；挑選典型菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，菌體形態(tài)為革蘭染色陰性、呈S形或海鷗展翅狀、無(wú)芽孢的細(xì)長(zhǎng)彎曲菌；試驗(yàn)菌觸酶、氧化酶和馬脲酸鹽水解試驗(yàn)均為陽(yáng)性。符合空腸彎曲菌的生長(zhǎng)條件、菌落形態(tài)和基礎(chǔ)生化特征。

2.2 系統(tǒng)生化鑒定結(jié)果 將試驗(yàn)菌和空腸彎曲菌參考菌株進(jìn)行全自動(dòng)微生物系統(tǒng)生化鑒定，結(jié)果顯示兩種菌均為空腸彎曲菌空腸亞種，鑒定度為99%，見(jiàn)表2。

表2 疑似空腸彎曲菌菌株的系統(tǒng)生化鑒定結(jié)果Tab.2 Identification on suspicious strain of Campylobacter jejuni by VITEK biochemical methods

2.3 多重PCR方法鑒定結(jié)果 采用特異性種屬多重PCR方法對(duì)試驗(yàn)菌株和參考菌株核酸進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示兩種菌均獲得857bp（16sRNA）及589bp（mapA）兩條特異性擴(kuò)增片斷，而陰性對(duì)照無(wú)條帶擴(kuò)增。

2.4 NAP－mPCR 方法鑒定結(jié)果采用 NAP－mPCR方法對(duì)試驗(yàn)菌和參考菌株核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種菌均獲得1 454bp和1 016bp的兩條特異性條帶，而陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)（圖1）。

3 討 論

空腸彎曲菌是引起世界食源性疾病的常見(jiàn)病原菌，常引起腸道感染，每1 000個(gè)腸道感染的病例就有1.5個(gè)會(huì)發(fā)展為菌血癥或敗血癥，而且0.1%的彎曲菌感染病例，尤其空腸彎曲感染會(huì)發(fā)展為格林巴利綜合征[4]。空腸彎曲菌分為兩個(gè)亞種：空腸亞種和德萊亞種。本試驗(yàn)研究證實(shí)從貴州省1例菌血癥患兒的血液中分離到空腸彎曲菌，經(jīng)傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法、特異性種屬mPCR方法和NAP－mPCR方法鑒定為空腸彎曲菌空腸亞種。

圖1 血培養(yǎng)空腸彎曲菌分離株NAP－mPCR結(jié)果Fig.1 NAP－mPCR results of the Campylobacter jejuni strain from blood culture

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察菌落生長(zhǎng)條件和菌落形態(tài)、菌落染色、氧化酶、觸酶試驗(yàn)及系統(tǒng)生化鑒定將試驗(yàn)菌鑒定為空腸彎曲菌空腸亞種，提示傳統(tǒng)的表型分型仍然可作為空腸彎曲菌分型的手段，但傳統(tǒng)的表型分型實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要的菌量較大，耗時(shí)較長(zhǎng)，且會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的判斷結(jié)果[3]。而PCR方法僅需單個(gè)菌落提取核酸進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，優(yōu)于傳統(tǒng)表型分型方法。本研究中采用基于16sRNA、mapA兩個(gè)基因的多重PCR技術(shù)將菌血癥患者血培養(yǎng)分離菌株鑒定為空腸彎曲菌，該方法亦曾在貴州省腹瀉病例空腸彎曲菌的鑒定中得到應(yīng)用[5]。

空腸彎曲菌亞種的表型鑒定主要通過(guò)硝酸鹽還原試驗(yàn)來(lái)判斷，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)需1～2d，所需菌量大，而且會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果，Miller[3]以硝酸鹽還原酶（nitrate reductase，nap）位點(diǎn)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的多重PCR（NAP－mPCR）檢測(cè)方法，對(duì)分離自臨床病例、動(dòng)物和環(huán)境的158株空腸彎曲菌空腸亞種和20株空腸彎曲菌德萊亞種研究結(jié)果顯示，該方法可對(duì)空腸彎曲菌空腸亞種（1 454bp，1 016bp）和德萊亞種（973bp或494bp）進(jìn)行100%的分型鑒定。本實(shí)驗(yàn)中GZ201201和CJ參考株經(jīng)NAP－mPCR方法檢測(cè)鑒定為空腸彎曲菌空腸亞種，與系統(tǒng)生化檢測(cè)結(jié)果完全一致。

最初，本菌株被醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室鑒定為“弗朗西斯菌”，與最終鑒定結(jié)果不符。因空腸彎曲菌培養(yǎng)條件苛刻，其在不同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)速度、形態(tài)大小及菌落革蘭染色形態(tài)均有不同，在不利于其生長(zhǎng)的條件下生長(zhǎng)速度緩慢，菌落小，革蘭染色出現(xiàn)菌體球形變化，僅少許呈彎曲狀，因此導(dǎo)致進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)選卡錯(cuò)誤而識(shí)別為其他菌。

彎曲菌是引起兒童腸炎的常見(jiàn)病原菌，其菌血癥的發(fā)生常發(fā)生于免疫缺陷的兒童[6]。本例空腸彎曲菌空腸亞種菌血癥患者為新生兒，免疫力低下，大片皮膚剝脫，皮膚屏障破壞，全身皮膚感染重，致使病原菌侵入血液引起菌血癥。貴州省1988年和2010年均在腹瀉病例的病原監(jiān)測(cè)中檢出空腸彎曲菌[7－8]。

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