李方暉

（肇慶學(xué)院 體育與健康學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(satellite cell,SC)是位于骨骼肌纖維的肌膜和基底膜之間的一種肌源性干細(xì)胞.SC所具有的再生及分化多潛能功能使其在骨骼肌損傷修復(fù)和可塑性方面起到關(guān)鍵性作用[1].在骨骼肌損傷的再生修復(fù)過程中,機(jī)體可通過自分泌和旁分泌的方式分泌生長因子，后者通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號蛋白酶表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對SC激活、分裂、增殖的控制.目前關(guān)于SC增殖過程中細(xì)胞應(yīng)激蛋白酶的表達(dá)變化規(guī)律的研究較少.本研究從與SC增殖關(guān)系密切的第Ⅲ類組蛋白去乙?；?(sirtuin1，SIRT1)入手，通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)小鼠C3H骨骼肌成肌細(xì)胞系(C2C12)，采用MTT比色法測定細(xì)胞的增殖活性，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量–聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測細(xì)胞增殖過程中SIRT1 mRNA的時(shí)相性表達(dá),為進(jìn)一步探討SC增殖影響因素，了解SC的生物特性，更好地利用影響因素指導(dǎo)臨床對骨骼肌損傷的治療，提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將含雙抗(青霉素100mg/mL、鏈霉素100mg/L)和10%胎牛血清(FBS)(杭州四季青)、22.5mmol/L D-葡萄糖的(DMEM)(Hyclone)培養(yǎng)液，置于含5%二氧化碳(CO2)、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞傳代常規(guī)胰酶消化，注意消化時(shí)間不宜過長，按1：3傳代，隔天換液.

1.2 指標(biāo)測試

1.2.1 骨骼成肌細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線和生長曲線

將生長良好的C2C12成肌細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)制成細(xì)胞懸液，取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞生長匯合后1～2 d開始實(shí)驗(yàn).取接種培養(yǎng)1 d的96孔板分別在移殖后1～5 d進(jìn)行MTT檢測.具體步驟：加入10μL每孔5.00 g/L的MTT，37℃孵育4 h，不吸出培養(yǎng)基直接加入甲瓚裂解液100μL每孔，繼續(xù)置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h至甲瓚全部溶解，于微量振蕩器上輕輕震蕩混勻，用酶標(biāo)儀(BIO-RAD550型，美國)測定570/655 nm處的吸光度值(OD值).每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.根據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞數(shù)目.

1.2.2 信使核糖核酸提取和檢測

分別在移殖后1～5 d收取細(xì)胞樣品，用RT-PCR檢測SIRT1、甘油醛–3–磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA表達(dá).去除培養(yǎng)皿中細(xì)胞培養(yǎng)液,用Trizol一步法提取總核糖核酸(RNA)，反轉(zhuǎn)錄和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)均參照試劑盒說明書(TaKaRa),引物見表1.反應(yīng)條件:預(yù)變性(95℃,20 s);40個(gè)PCR循環(huán)(95℃,5 s;60℃，20 s，收集熒光),擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,再變性(95℃,75s),退火(55℃,60 s),然后從55℃緩慢加熱到95℃,15 s;每1℃收集熒光.結(jié)果表明,熔解曲線只顯示一個(gè)主波峰.說明PCR擴(kuò)增的特異性較高,符合熒光定量PCR的技術(shù)要求(如圖1).反應(yīng)結(jié)束后,RT-PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參,根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算各樣品目的基因的相對表達(dá)量.

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列一覽表

圖1 SIRT1基因PCR的擴(kuò)增曲線(a)和溶解曲線(b)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理.結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示,同一指標(biāo)不同組間進(jìn)行方差分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平定為P<0.05，OD值與SIRT1 mRNA表達(dá)量之間進(jìn)行相關(guān)性分析.

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)C2C12成肌細(xì)胞的生長特性

圖2顯示，接種后由于細(xì)胞的貼壁和伸展，潛伏期為1～2 d.接種后第3天的細(xì)胞增殖活性與第1和第2天都有顯著性差異(P<0.05)，第4天和第5天與第1和第2天相比都有極顯著性差異(P<0.01).這說明，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞自接種后第3天進(jìn)入對數(shù)生長期，至第5天開始進(jìn)入到平臺期.加入MTT溶液之前觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)已有部分骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞開始相互融合形成肌管細(xì)胞.

2.2 SIRT1 mRNA表達(dá)

圖3結(jié)果顯示：與第1天相比,盡管第2天的SIRT1 mRNA表達(dá)增加1.5倍，但沒有顯著性差異(P>0.05)；第3天增加了1.8倍(P<0.05)；第4天和第5天分別增加2.3和2.4倍(P<0.01).此外，與第2天相比，第4天和第5天SIRT1 mRNA表達(dá)也分別增加1.5和1.6倍(P<0.05).

圖2 C2C12成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長曲線

圖3 C2C12成肌細(xì)胞SIRT1 mRNA表達(dá)的時(shí)相性

2.3 相關(guān)性分析

將細(xì)胞增殖的OD值和3個(gè)基因的mRNA進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，SIRT1 mRNA相對表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活性呈中度正相關(guān)(R2=0.873；P=0.02)(見圖4).

3 討論

圖4 C2C12成肌細(xì)胞的增殖活性(OD值)和SIRT1 mRNA相關(guān)性

第Ⅲ類組蛋白去乙?；?(SIRT1)作為應(yīng)激因子，可通過調(diào)控細(xì)胞多種生理功能延長壽命[2].研究表明，SIRT1可調(diào)控成肌細(xì)胞生理功能，如增殖和分化[3-6].MCBURNEY MW等[3]通過敲除SIRT1基因發(fā)現(xiàn)，大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖活性削弱.衰老個(gè)體成肌細(xì)胞增殖活性降低可能與SIRT1活性降低有關(guān)[4].LIFanghui等[5]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1 mRNA表達(dá)減少跟高糖誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞增殖功能紊亂相關(guān).與高糖培養(yǎng)類似，高氧(20%)也能導(dǎo)致成肌細(xì)胞增殖功能失調(diào).RATHBONE等[6]研究發(fā)現(xiàn)SIRT1表達(dá)減少介導(dǎo)高氧誘導(dǎo)的肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖抑制作用.直接補(bǔ)充SIRT1小分子活性物質(zhì)白藜蘆醇能促進(jìn)高氧條件或高糖環(huán)境下的成肌細(xì)胞增殖[6].提示成肌細(xì)胞增殖失調(diào)與SIRT1表達(dá)下調(diào)有關(guān).

本文進(jìn)一步研究了C2C12成肌細(xì)胞正常增殖過程的中SIRT1 mRNA表達(dá)后發(fā)現(xiàn)：前2 d增殖潛伏期的SIRT1表達(dá)是穩(wěn)定的，盡管稍微有所增加，但不具有顯著性差異;第3天后SIRT1 mRNA表達(dá)出現(xiàn)遞增趨勢.前人研究也發(fā)現(xiàn)，潛伏期單個(gè)細(xì)胞分裂周期過程中的2～18 h SIRT1表達(dá)是穩(wěn)定的[7]，第3 d后細(xì)胞增殖進(jìn)入對數(shù)期，細(xì)胞增殖速度加快.增殖速度越快勢必導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制速率越快,DNA復(fù)制過程的錯(cuò)誤率就會(huì)增加.由于SIRT1具有維持基因組的功能穩(wěn)定[7]和端粒酶活性[8]的作用，因此，SIRT1表達(dá)增加剛好配合對數(shù)增殖期的細(xì)胞增殖速度，進(jìn)而維持增殖穩(wěn)定性.圖4顯示C2C12成肌細(xì)胞整個(gè)增殖過程與SIRT1 mRNA表達(dá)有中度的相關(guān)性.這也得到了成纖維細(xì)胞研究的佐證[8].增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是評價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo).成纖維細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1蛋白表達(dá)與PCNA成中度正相關(guān)[8].人胚胎干細(xì)胞增殖潛能強(qiáng)于誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞，而后者強(qiáng)于正常成人血管內(nèi)皮細(xì)胞.研究也發(fā)現(xiàn)，這3種細(xì)胞增殖潛能的高低是由SIRT1表達(dá)決定的，人胚胎干細(xì)胞SIRT1表達(dá)最高，誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞次之，成人血管內(nèi)皮細(xì)胞最低[9].這也間接說明了SIRT1表達(dá)跟不同類型細(xì)胞增殖活性成正相關(guān).

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