劉愛(ài)軍 陳杏曄 廣州中醫(yī)藥大學(xué)組胚教研室（廣州510006）

△廣州中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)研究生（廣州510006）

皮膚覆蓋在人體表面，在日常生活中極易受到損傷，毛囊真皮的成纖維細(xì)胞（fibroblast）能分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、FN（fibronectin）等ECM成分和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（base fibroblast growth factor，bFGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多種細(xì)胞因子，能促進(jìn)各種生長(zhǎng)因子的分泌，誘導(dǎo)皮膚表皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的完整修復(fù)。七厘散是著名的傷科常用中成藥，本項(xiàng)目組前期研究證明七厘散能促進(jìn)創(chuàng)面成纖維細(xì)胞分泌膠原纖維，促進(jìn)新生毛細(xì)新生，修復(fù)表皮和毛囊，但中藥促進(jìn)皮膚愈合的作用機(jī)理并不清楚。本文通過(guò)探討七厘散含藥血清對(duì)分離培養(yǎng)的SD乳鼠觸須部毛囊真皮根鞘細(xì)胞增殖的影響，為更加深入的研究中藥促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的分子機(jī)制；尋找切實(shí)、有效的藥物作用靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生3d的SD乳鼠（雌雄不拘），用于取觸須部毛囊。雄性SD大鼠（質(zhì)量180－200g），用于制備含藥血清。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 HG－DMEM培養(yǎng)（美國(guó)Gibco公司）；優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS）（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）；青霉素/鏈霉素（Hyclone公司）；0.01mmol/L PBS（Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；RT－2100C酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；Ⅰ抗：層黏連蛋白（Laminin，LN）、纖黏連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）、波形蛋白（Vimentin）（均購(gòu)自武漢博士德試劑公司）；Ⅱ抗IgG、SABC－Cy3試劑盒（武漢博士德試劑公司）；核熒光標(biāo)記物DAPI（美國(guó)Sigma公司）。中成藥七厘散（批號(hào)：0100033，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠）

1.3 方法

1.3.1 SD乳鼠毛囊真皮細(xì)胞的獲取 將出生3d的同一胎次的、正常發(fā)育的SD乳鼠10只浸泡于75%酒精中，5min×3次。剪去帶有完整觸須部毛囊的皮膚，雙抗D－Hank’s液洗1次，無(wú)雙抗D－Hank’s液洗2次。超凈工作臺(tái)內(nèi)分離出完整的觸須毛囊，均勻置于T25培養(yǎng)瓶，添加少量10%FBS的HGDMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，24h后添加培養(yǎng)基，細(xì)胞長(zhǎng)滿后按1∶3進(jìn)行傳代。

1.3.2 細(xì)胞爬片的制作 將P2代細(xì)胞消化稀釋成細(xì)胞懸液，按1×107/L接種于放有消毒蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，每孔接種1mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿蓋玻片50%左右時(shí)，取出蓋玻片，0.01mmol/L PBS洗3次，中性甲醛固定30min，0.01mmol/L PBS洗3次。

1.3.3 免疫熒光顯微鏡檢測(cè) P3代毛囊真皮細(xì)胞爬片，免疫熒光檢測(cè)LN、FN、Vimentin的表達(dá)（實(shí)驗(yàn)步驟按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），Ⅰ抗效價(jià)均為1∶100，Ⅱ抗效價(jià)1∶100，SABC－Cy3顯色后，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.4 七厘散含藥血清的制備 七厘散灌胃液按0.15g/1.5mL配制，每天每只大鼠灌胃兩次，間隔12h，灌胃量1.5mL/200g，連續(xù)灌胃，分別在3d、5d、7d腹主動(dòng)脈血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)共灌胃5只大鼠，取血當(dāng)日早晨再灌胃1次，間隔1h，麻醉大鼠，打開(kāi)腹腔，負(fù)壓管抽腹主動(dòng)脈血。靜置30min，3000r/min離心10min，吸取上層血清，將所得同一時(shí)間點(diǎn)的5只大鼠的血清混合，50℃滅活30min，0.2μm 濾膜過(guò)濾除菌，分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 MTT檢測(cè) 七厘散含藥血清對(duì)P3代毛囊真皮細(xì)胞增殖的影響 將P2代毛囊細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按3000個(gè)/孔種植入96孔板，24h后更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；24h后棄培養(yǎng)基，將細(xì)胞分成空白對(duì)照組、無(wú)血清組、0%含藥血清組、2.5%含藥血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組，F(xiàn)BS補(bǔ)足血清總體積百分比為20%，每組7個(gè)復(fù)孔，分別添加相應(yīng)的藥物100μL/孔；24h后棄培養(yǎng)基，加入0.5mg/mL MTT 100μL/孔；37℃、5%CO2條 件 下 放 置 4h，加 DMSO100μL/孔，震蕩10min，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析（one－way ANOVA）進(jìn)行組間均數(shù)的比較，兩兩組間均數(shù)比較視方差齊性檢驗(yàn)（以0.1作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行Levene檢驗(yàn)）結(jié)果，當(dāng)方差齊同時(shí)，用LSD檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)，用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SD乳鼠毛囊細(xì)胞分離培養(yǎng)結(jié)果 種植后細(xì)胞很快貼壁，24h后可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈，可見(jiàn)從SD乳鼠毛囊有成纖維狀細(xì)胞遷出（圖1），3d細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶約80%左右，進(jìn)行傳代，殘留的毛囊及組織塊隨著傳代和換液逐漸除去，細(xì)胞傳至P3代時(shí)呈較純化的成纖維狀細(xì)胞（圖2）。

2.2 SD乳鼠毛囊真皮細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

分離培養(yǎng)的SD乳鼠毛囊真皮成纖維狀細(xì)胞，免疫熒光檢測(cè)FN（圖3）、LN（圖4）、Vimentin（圖5）表達(dá)陽(yáng)性。

2.3 MTT檢測(cè)七厘散含藥血清對(duì)P3代毛囊真皮細(xì)胞增殖的影響 七厘散灌胃后，3d、5d、7d含藥血清對(duì)P3代毛囊真皮細(xì)胞24h增殖的作用趨勢(shì)相同，均在含藥血清5%組對(duì)細(xì)胞促增殖作用達(dá)到最大，并且促增殖作用優(yōu)于普通的胎牛血清；之后隨著含藥血清體積百分比增加促增殖作用下降。3d和5d含藥血清組的促增殖作用優(yōu)于7d含藥血清組。

表1 七厘散含藥血清作用24h對(duì)SD乳鼠毛囊成纖維細(xì)胞增殖的影響

取3d、5d、7d含藥血清組的數(shù)值分別進(jìn)行單因素ANOVA分析，3d組F＝0.014，采用LSD法，發(fā)現(xiàn)不同體積分?jǐn)?shù)含藥血清組間有顯著性差異（P＝0.03），3d含藥血清組中5%含藥血清組刺激細(xì)胞增殖效果最佳；5d組、7d組方差不齊（分別為F＝0242，F(xiàn)＝0.219），用Tamhane’s T2檢驗(yàn)方法，空白組與其他組之間有顯著性差異（P＜0.004），其它組間差異均無(wú)顯著性意義（P＞0.05），可見(jiàn)3d組5%七厘散含藥血清對(duì)細(xì)胞促增殖作用最好。

3 討 論FSC是組織工程皮膚理想的種子細(xì)胞，但是毛囊干細(xì)胞的有效增殖和定向分化至今仍未解決［1－4］。毛囊真皮根鞘中的成纖維細(xì)胞能分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、FN等ECM 成分和bFGF、VEGF、EGF等多種細(xì)胞因子［5，6］，能促進(jìn)FSC分化為表皮細(xì)胞并促進(jìn)毛囊的完整修復(fù)，因此深入研究毛囊真皮鞘成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性、利用其改善毛囊干細(xì)胞的增殖和定向分化能力具有重要意義。

七厘散是著名的傷科常用中成藥，廣泛應(yīng)用于外科瘡瘍、燙傷、跌打損傷、金刃重傷等病癥，療效顯著。本項(xiàng)目組前期研究證明七厘散作用于小鼠觸須部去表皮創(chuàng)面，具有明顯的抗炎、促修復(fù)作用。創(chuàng)面修復(fù)早期有大量炎細(xì)胞滲出、浸潤(rùn)；修復(fù)中期表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖明顯，膠原纖維的合成和分泌增加；修復(fù)晚期真皮膠原纖維排列規(guī)則，新生毛細(xì)血管較多，創(chuàng)面表皮修復(fù)，毛囊重新形成，其療效優(yōu)于臨床西藥EGF，說(shuō)明中藥通過(guò)對(duì)創(chuàng)面微環(huán)境的改善，促進(jìn)膠原纖維的合成和分泌，膠原纖維能有效促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移和分化［7］，能促進(jìn)表皮及毛囊的重新生成［8］。

本實(shí)驗(yàn)免疫熒光檢測(cè)所分離培養(yǎng)的毛囊真皮細(xì)胞FN、LN、Vimentin表達(dá)陽(yáng)性，說(shuō)明所培養(yǎng)的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。七厘散灌胃后3d、5d、7d的含藥血清按不同體積百分比作用于體外培養(yǎng)的毛囊真皮成纖維細(xì)胞24h，7d七厘散含藥血清組較3d組和5d組促增殖作用較差。七厘散含藥血清體積百分?jǐn)?shù)5%促增殖效果最佳，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析發(fā)現(xiàn)，3d組和5d組優(yōu)于7d組，且3d組和5d組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明灌胃3d即為最佳的時(shí)間點(diǎn)。每組中均隨著七厘散含藥血清體積百分比增加，促毛囊真皮成纖維細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng)，當(dāng)七厘散含藥血清體積百分?jǐn)?shù)5%促增殖效果最佳，之后隨著含藥血清體積百分比增加，促增殖作用下降，說(shuō)明七厘散對(duì)真皮成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)是雙向的，在創(chuàng)傷修復(fù)中以促增殖為主，當(dāng)修復(fù)到一定程度，促增殖作用下降，防止膠原纖維過(guò)度堆積，形成瘢痕組織，充分體現(xiàn)了中藥促進(jìn)皮膚愈合的整體性和雙向性調(diào)節(jié)［9，10］。

［1］Pontiggia L，Biedermann T，Meuli M，et al.Markers to evaluate the quality and self－renewing potential of engineered human skin substitutes in vitro and after transplantation［J］.J Invest Dermatol，2009，129（2）：480－490.

［2］Plikus MV，Mayer JA，de la Cruz D，et al.Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration［J］.Nature，2008，451（7176）：340－344.

［3］Qi SH，Liu P，Xie JL，et al.Experimental study on repairing of nude mice skin defects with composite skin consisting of xenogeneic dermis and epidermal stem cells and hair follicle dermal papilla cells［J］.Burns，2008，34（3）：385－392.

［4］朱堂友，郝 飛，伍津津，等.人毛囊細(xì)胞來(lái)源雙層皮膚替代物的構(gòu)建和組織學(xué)特征［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（12）：1187－1189.

［5］Charruyer A，Ghadially R.Stem cells and tissue－engineered skin［J］.Skin Pharmacol Physiol，2009，22（2）：55－62.

［6］Metcalfe AD，F(xiàn)erguson MW.Bioengineering skin using mechanisms of regeneration and repair［J］.Biomaterials，2007，28（34）：5100－5113.

［7］劉愛(ài)軍，易 華，杜標(biāo)炎.龍血竭對(duì)小鼠觸須部毛囊干細(xì)胞增殖和分化的影響［J］.陜西中醫(yī)，2011，32（8）：1089－1092.

［8］劉愛(ài)軍，易 華，杜標(biāo)炎.七厘散促小鼠觸須部創(chuàng)面修復(fù)及部分機(jī)制探討［J］.陜西中醫(yī)，2012，33（4）：490－492.

［9］吳江群，聶興舉，秦澤蓮.氧化苦參堿對(duì)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖凋亡的影響［J］.中國(guó)微創(chuàng)外科雜志，2011，11（3）：259－263.

［10］李鳳玉，賈國(guó)洪，萬(wàn) 立，等.脂多糖對(duì)增生性瘢痕患者正常皮膚成纖維細(xì)胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA和膠原酶 mRNA表達(dá)的影響［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2011，18（2）：161－164.