黃奕雯，何曉芳，陸永躍，曾 玲，程代鳳

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)紅火蟻研究中心，廣東 廣州510642

紅火蟻Solenopsis invicta Buren 是一種入侵性強(qiáng)的有害生物(Vinson，1997)。2003年10月以來，我國臺灣、廣東、香港、澳門、廣西、湖南、福建、江西、海南、云南、四川等地區(qū)先后報道了紅火蟻的發(fā)生及危害(陸永躍等，2008、2014;曾玲等，2005a、2005b;Wang et al.，2013)。在新入侵地，該蟻是否因為入侵來源不同或是為了適應(yīng)新環(huán)境變化而發(fā)生種群遺傳分化等問題值得關(guān)注。He et al.(2006)基于COI 基因分析了境內(nèi)13 個種群的單倍型，認(rèn)為香港是入侵中國的紅火蟻種群中遺傳多樣性最豐富的地區(qū)。邵敬國等(2008a、2008b)利用GP-9 特異性引物和微衛(wèi)星位點研究了我國紅火蟻的社會型和地理種群間遺傳差異性。利用微衛(wèi)星(simple sequence repeat，SSR)的多態(tài)性來分析物種進(jìn)化、生物群體內(nèi)的遺傳變異以及種間關(guān)系，甚至在生物個體鑒定等方面已有許多報道:在韓國，研究人員利用SSR 技術(shù)成功評估了芒草Miscanthus的遺傳 多 樣 性(Yook et al.，2014);Wang et al.(2005)利用SSR 技術(shù)成功揭示了昆蟲致病真菌白僵菌Beauveria bassiana (Bals)Vuill.菌株的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu);在果蠅Drosophila melanogaster Meigen 中也有大量利用SSR 技術(shù)進(jìn)行相關(guān)研究的報道(Prokop ＆ Meinertzhagen，2006)。同時，在社會性昆蟲協(xié)同進(jìn)化過程中的行為研究和親緣選擇假說中，微衛(wèi)星標(biāo)記也已被大量應(yīng)用(Aanen ＆Eggleton，2005;Cheng et al.，2013)。

了解紅火蟻入侵種群的遺傳結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性，不僅有助于預(yù)測這一物種的入侵潛力并推斷其生態(tài)和進(jìn)化過程，而且有助于制定相應(yīng)的控制和管理策略，從而采取有效的措施阻止其進(jìn)一步擴(kuò)散，并減少危害。本研究利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)研究中國紅火蟻種群的遺傳結(jié)構(gòu)，希望能夠進(jìn)一步揭示該蟻種群間存在的遺傳變異及其多樣性，為控制該蟻提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紅火蟻樣品來自廣東、廣西、福建、香港等中國4 個紅火蟻發(fā)生省份(或地區(qū))的14 個種群，以及美國阿拉巴馬州的1 個種群。除田間采集的紅火蟻樣品外，其他樣品均為浸泡于75%或95%酒精中、置于－40 ℃低溫冰箱保存的標(biāo)本(表1)。

表1 供試蟲體樣品信息Table 1 Information of samples used in the study

1.2 試驗方法

1.2.1 供試紅火蟻的DNA 提取 分別從每個蟻巢中取1 ～10 頭工蟻個體，對整頭工蟻進(jìn)行DNA 抽提。其中，田間采集、實驗室飼養(yǎng)的紅火蟻活體，先放入低溫冰箱速凍至?xí)炘龠M(jìn)行研磨，酒精浸泡的紅火蟻標(biāo)本需用200 μL 的TE Buffer 浸泡過夜后再提取DNA，以去除其他化學(xué)物質(zhì)對PCR 等后續(xù)試驗的影響。用天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒抽提DNA，詳細(xì)步驟按其使用說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 SSR PCR 擴(kuò)增 參考Krieger ＆ Keller(1997)的SSR 引物序列，合成8 對引物(表2)，并參照其反應(yīng)體系和程序進(jìn)行紅火蟻工蟻的SSRPCR 擴(kuò)增。

表2 用于工蟻SSR-PCR 擴(kuò)增的引物序列Table 2 Sequences of primers used in the SSR-PCR

1.2.3 SSR-PCR 產(chǎn)物的PAGE 檢測 在25 μL 體系的SSR-PCR 產(chǎn)物中加入5 μL 6 ×Loading Buffer混勻，吸取1.5 μL 混合液進(jìn)行加樣電泳，控制電壓為80 V 恒壓，電泳100 min。采用快速銀染法進(jìn)行染色，將顯影后的PAGE 膠置于凝膠成像系統(tǒng)中成像觀察并拍照，將所得圖像直接在成像系統(tǒng)中進(jìn)行處理，對SSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果讀帶，根據(jù)50 bp DNA Ladder 標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量標(biāo)記標(biāo)定目的片段分子質(zhì)量的大小，記錄清晰、穩(wěn)定出現(xiàn)且產(chǎn)物長度在100 ～200 bp 的擴(kuò)增帶。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

按照電泳圖譜中同一位置上的DNA 條帶進(jìn)行統(tǒng)計，以二倍體形式記錄擴(kuò)增帶，從大到小依次記作A、B、C……(李偉豐等，2007)。應(yīng)用Popgene 1.32軟件對全部種群和各單個種群分別進(jìn)行遺傳參數(shù)分析，在假定各種群處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)下，計算多態(tài)帶數(shù)(Np)、多態(tài)位點百分率(P)、觀測等位基因數(shù)(NA)、有效等位基因數(shù)(NE)、基因多樣性指數(shù)(Nei's)、Shannon 信息指數(shù)(I)、表觀雜合度(HO)和預(yù)期雜合度(HE)、種群內(nèi)近交系數(shù)(FIS)、總近交系數(shù)(FIT)、種群間分化系數(shù)(FST)、種群間基因流(Nem)、Nei's 標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(D)和遺傳相似度(I)。根據(jù)D，利用NTSYSpc2.1 軟件對各種群進(jìn)行非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

在8 對微衛(wèi)星擴(kuò)增位點中，每個位點在這15個紅火蟻種群中都出現(xiàn)清晰的擴(kuò)增條帶，沒有出現(xiàn)零等位基因的情況。但在Sol-52 位點上只出現(xiàn)1個等位基因，且沒有表現(xiàn)出多態(tài)性。

2.2 紅火蟻地理種群的遺傳多樣性

對7 對表現(xiàn)出多態(tài)性的擴(kuò)增結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，7對微衛(wèi)星引物在15 個紅火蟻種群中共檢測到28個等位基因，每個位點獲得的等位基因數(shù)有2 ～6個，其中Sol-20 位點上擁有最多的等位基因為6個，Sol-6 位點和Sol-18 位點上的等位基因最少，僅為2 個(表3)。這表明用于SSR-PCR 擴(kuò)增的這7對引物具有一定的特異性。各微衛(wèi)星位點的表觀雜合度HO在0.1957 ～0.3582 之間，平均值為0.2802;預(yù)期雜合度HE在0.1705 ～0.3199 之間，平均值為0.2623。各位點的等位基因表觀雜合度與預(yù)期雜合度基本一致，均相差不大，均符合Hardy-Weinberg 平衡。

15 個紅火蟻地理種群的遺傳變異參數(shù)見表4。各種群的觀測等位基因數(shù)NA在2.1057 ～3.4215 之間，平均為2.7028;有效等位基因數(shù)NE在1.5095 ～2.8253 之間，平均為2.1066。Shannon 信息指數(shù)I在0.2522(廣西南寧)～0.3524(廣東深圳)之間，平均為0.3174;表觀雜合度HO在0.2433(廣西南寧)～0.3284(廣東深圳)之間，平均為0.2848;預(yù)期雜合度HE在0.2324(廣西南寧)～0.3096(廣東深圳)之間，平均為0.2708;基因多樣性指數(shù)Nei's 在0.1977(廣西南寧)～0.2979(廣東深圳)之間，平均為0.2629;各個種群內(nèi)的多態(tài)位點百分率P 為37.17% ～49.73%，平均每個種群為43.63%，最高的是廣東深圳種群，最低的是廣西南寧種群。從表中可以看出，種群的Shannon 信息指數(shù)I、表觀雜合度HO、預(yù)期雜合度HE、基因多樣性指數(shù)Nei's 以及多態(tài)位點百分率P 呈正相關(guān)。

表3 7 個微衛(wèi)星位點的遺傳變異參數(shù)、F-statistics 和基因流Table 3 Indices of genetic diversity and genes flow deduced by 7 SSRs primers

表4 15 個紅火蟻地理種群在7 個微衛(wèi)星位點上的遺傳變異參數(shù)Table 4 Indices of genetic diversity of 15 S.invicta populations based the 7 SSRs primers

2.3 紅火蟻地理種群的遺傳分化

15 個紅火蟻地理種群在7 個微衛(wèi)星位點上的F-statistics 分析結(jié)果見表3。從表中可以看出，15個紅火蟻地理種群在各微衛(wèi)星位點上的FIS為0.1141(Sol-49)～0.2445(Sol-11)，平均值0.1616;FIT為0.2111(Sol-49)～0.3381(Sol-11)，平均值0.2820。種群間的分化系數(shù)FST在Sol-18 位點最大為0.5492，在Sol-11 位點最小為0.2769，F(xiàn)ST平均值為0.4258。從FST可知，供試紅火蟻種群有42.58%的遺傳變異發(fā)生在種群間，57.42%的遺傳變異發(fā)生在種群內(nèi)。種群間的基因流Nem均較小，范圍從0.4105(Sol-18)～1.3055(Sol-11)，平均值僅為0.7442。

供試紅火蟻地理種群間Nei's 標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離D和遺傳相似度I 見表5，從表中可以看出，所研究的15 個紅火蟻地理種群兩兩之間的遺傳相似度范圍在0.7625 ～1.0000 之間，均大于0.6，表明各種群相互之間存在著非常頻繁的基因交流。Nei's 標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離D 顯示出，河源種群和中山種群之間的遺傳距離最大為0.2711，集美種群和廈門種群之間的遺傳距離最小為0，幾乎沒有遺傳差異。其中，河源紅火蟻地理種群與其他地理種群間的遺傳距離范圍在0.1248 ～0.2711 之間，均相對高于其他各種群間的遺傳距離;而美國阿拉巴馬州紅火蟻種群與國內(nèi)紅火蟻各種群之間的遺傳距離在0.0244 ～0.1651 之間，表明其與國內(nèi)紅火蟻種群間的遺傳差異不大。

表5 15 個紅火蟻地理種群間Nei's 標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(D)和遺傳相似度(I)Table 5 Nei's genetic distance and genetic identity coefficient of the 15 population for S.invicta

2.4 聚類分析

根據(jù)Nei's 標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離，利用NTSYSpc2.1 中的UPGMA 法對15 個紅火蟻地理種群進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1。從圖中可以看出，系統(tǒng)發(fā)育樹首先分為2 個大分支，其中河源種群與其他種群之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，存在明顯的遺傳分化，成為獨立的一支。然后其他種群又由2 個分支組成，中山種群與其他剩余種群之間的遺傳距離相對較遠(yuǎn)，成為獨立的一支;而其他剩余種群又明顯地分為2 個大分支，香港種群和珠海種群聚為一支，深圳、梅州、博羅、增城、廣州、廈門、集美、泉州、東莞、南寧與美國阿拉巴馬州種群又構(gòu)成一個十分復(fù)雜的分支。

圖1 紅火蟻地理種群間Nei's 標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離的UPGMA 法聚類圖Fig.1 UPGMA cluster analysis using the Nei's standard genetic distance indices for S.invicta populations

3 討論

3.1 Hardy-Weinberg 平衡

Hardy-Weinberg 平衡定律也叫遺傳平衡定律，是指在理想狀態(tài)下，各等位基因的頻率和等位基因的基因型頻率在遺傳中穩(wěn)定不變，即保持著基因平衡。所謂的理想狀態(tài)需滿足5 個條件:種群足夠大，種群中個體間可以隨機(jī)交配，不發(fā)生突變，沒有新基因加入，沒有自然選擇。顯然，遺傳平衡在自然狀態(tài)下是無法達(dá)到的，但在一個足夠大的種群中，如果個體間自由交配，且沒有明顯的自然選擇，往往可以近似地看作符合遺傳平衡(Stark，2006)。本研究中的15 個紅火蟻地理種群在各微衛(wèi)星位點上的等位基因表觀雜合度與預(yù)期雜合度基本相符，均符合Hardy-Weinberg 平衡，即表明各等位基因的基因型頻率近似穩(wěn)定。

3.2 紅火蟻地理種群的遺傳多樣性分析

一般所說的遺傳多樣性是指種內(nèi)的遺傳多樣性，即種內(nèi)個體之間或一個群體內(nèi)不同個體之間的遺傳變異總和，它反映了一個物種適應(yīng)環(huán)境的能力及其被改造和利用的潛力。

在自然進(jìn)化過程中，如果種群發(fā)生一定程度的隔離，那么，地理種群間的遺傳差異就會逐步增加，而地理種群內(nèi)的遺傳差異則會逐漸減小，從而使得地理種群內(nèi)以及地理種群間雜合體的比例發(fā)生變化。因此，種群雜合度的高低反映了群體的遺傳一致性程度，種群雜合度越低，表明該種群的遺傳一致性越高，從而導(dǎo)致種群遺傳變異程度越低，種群遺傳多樣性越低(李偉豐等，2007)。本研究中的15個紅火蟻地理種群的表觀雜合度HO在0.2433(廣西南寧)～0.3284(廣東深圳)之間，平均為0.2848;預(yù)期雜合度HE在0.2324(廣西南寧)～0.3096(廣東深圳)之間，平均為0.2708?？梢钥闯觯瑥V東深圳紅火蟻種群的表觀雜合度和預(yù)期雜合度相對于其他種群均較高，表明這個地區(qū)的紅火蟻種群的遺傳變異程度較高，遺傳多樣性也相對更豐富一些。

Nei ＆ Li(1979)認(rèn)為，基因多樣性指數(shù)是群體內(nèi)基因變異的理想測度，它可以適用于任何生物。15 個紅火蟻種群的基因多樣性指數(shù)Nei's 在0.1977(廣西南寧)～0.2979(廣東深圳)之間，平均為0.2629。廣東深圳種群的基因多樣性指數(shù)在所有種群中最高，這與該種群擁有最高的表觀雜合度和預(yù)期雜合度相一致，表明廣東深圳的紅火蟻種群內(nèi)的遺傳分化程度和遺傳多樣性比較高。Botstein et al.(1980)首先提出了衡量基因變異程度的多態(tài)位點百分率P，當(dāng)P ＞50%時為高度多態(tài)位點，25% ＜P≤50%時為中度多態(tài)位點，當(dāng)P≤25%時為低度多態(tài)位點。15 個紅火蟻地理種群在7 個微衛(wèi)星位點上的多態(tài)位點百分率P 為37.17% ～49.73%，平均為43.63%，表明這7 個微衛(wèi)星位點均具有中等程度的多態(tài)性，可以作為有效的遺傳標(biāo)記用于紅火蟻地理種群遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的分析，同時表明紅火蟻種群具有比較豐富的遺傳多樣性。

3.3 紅火蟻地理種群的遺傳分化與變異

產(chǎn)生遺傳分化的原因有多方面，包括有性生殖、體細(xì)胞突變、選擇、基因流、遺傳漂變以及環(huán)境的影響等(李偉豐等，2007)。本試驗所研究的15個紅火蟻種群分別來自我國廣東、廣西、福建、香港4 個省(地區(qū))和美國阿拉巴馬州，在不同生境作用下，紅火蟻種群會形成一定程度的遺傳分化，種群間分化系數(shù)FST值越大，說明種群的分化程度越高。15 個紅火蟻地理種群間分化系數(shù)的平均值達(dá)到0.4258，表明各種群之間有較高程度的分化，接近一半的遺傳變異發(fā)生在種群間。種群內(nèi)近交系數(shù)FIS與總近交系數(shù)FIT的值均較小，平均值分別僅為0.1616與0.2820，表明這15 個種群在各種群內(nèi)部的近交程度都比較低。

基因流是指生物個體從其發(fā)生地分散出去而導(dǎo)致不同種群間基因交流的過程，可發(fā)生在同種或不同種的生物種群之間?；蛄鞯膹?qiáng)弱程度因不同的種群、不同的時間地點而有很大差異，但其基本作用是削弱種群間的遺傳差異，提高遺傳多樣性的程度。由此可見，基因流是影響種群遺傳分化的另一個重要因素，高水平的基因流可以防止種群間的遺傳分化，使種群趨于一致。而遺傳漂變是指由于某種隨機(jī)因素，某一等位基因的頻率在群體中出現(xiàn)世代傳遞的波動現(xiàn)象。當(dāng)種群間的基因流Nem＞1時即能有效抑制由遺傳漂變引起的遺傳分化，當(dāng)Nem＜1 時基因流就不足以抵制種群內(nèi)因遺傳漂變而引起的種群分化(Slatkin，1985)。15 個紅火蟻地理種群間的Nem僅為0.7442，說明各種群間存在著較高程度的遺傳分化，而除了地理隔離與環(huán)境因素，遺傳漂變很可能是引起較大分化的一個重要原因。

利用遺傳距離可以估測種群間的進(jìn)化關(guān)系，關(guān)于計算遺傳距離的方法很多，但目前應(yīng)用較廣泛的遺傳距離指標(biāo)是Nei ＆ Li(1979)于20 世紀(jì)70年代提出來的，即為Nei's 標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離。根據(jù)遺傳距離D 顯示，河源紅火蟻種群與其他種群間的遺傳距離均相對高于其他各種群間的遺傳距離，表明河源種群與其他地理種群之間的遺傳差異比較大，存在明顯的遺傳分化，可能是較為原始的類型;而美國阿拉巴馬州紅火蟻種群與國內(nèi)紅火蟻各種群之間的遺傳距離均較小，表明其與國內(nèi)紅火蟻種群間的遺傳差異不大。從根據(jù)Nei's 標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離構(gòu)建的UPGMA 聚類圖可以看出，廈門和集美的紅火蟻種群聚為一支，廣州五山和增城的紅火蟻種群聚為一支，這說明遺傳距離與實際地理距離之間有一定的關(guān)系;但是美國阿拉巴馬州的紅火蟻種群與國內(nèi)紅火蟻種群之間的遺傳距離比起河源種群與國內(nèi)其他種群之間的遺傳距離卻小得多，這說明遺傳距離與實際地理距離之間不一定呈正相關(guān)。從供試紅火蟻種群復(fù)雜的遺傳結(jié)構(gòu)可以看出，中國紅火蟻各種群間既存在著由于地理因素造成的遺傳分化，又存在著因為種苗、花卉、草皮等帶土植物的貿(mào)易調(diào)運(yùn)所帶來的種群擴(kuò)散。

3.4 中國紅火蟻種群的擴(kuò)散途徑

一般來說，在正常的種群擴(kuò)散過程中，如果沒有大的自然屏障，地理上相鄰地區(qū)種群間的生物多樣性應(yīng)該比較接近。從UPGMA 聚類圖中可以看到，廈門和集美、廣州和增城這些地理距離相近地區(qū)的紅火蟻種群都首先聚成了一支，說明它們之間的遺傳距離較近，可能是紅火蟻種群通過自然擴(kuò)散而形成。

從UPGMA 聚類圖上還可以看到，廣州五山和增城的紅火蟻種群與廈門和集美種群聚成一支，其間的遺傳距離小于與廣東其他地區(qū)紅火蟻種群之間的遺傳距離，這些地區(qū)的地理距離相隔較遠(yuǎn)，且多后型蟻巢的擴(kuò)散方式主要是通過分巢進(jìn)行，獨立建巢能力和遠(yuǎn)距離遷移能力都比較弱(陸永躍等，2008;許益鐫等，2006)，因此認(rèn)為紅火蟻不可能靠其自身的遷飛能力擴(kuò)散，只能靠人為傳播，如因園藝植物污染、草皮污染、土壤廢土移動、園藝農(nóng)耕機(jī)具設(shè)備污染、空貨柜污染、車輛等運(yùn)輸工具污染等而進(jìn)行長距離傳播。由于這些地區(qū)的生境都適宜紅火蟻的定殖，當(dāng)被紅火蟻污染的帶土植物經(jīng)過頻繁調(diào)運(yùn)而又未做有效處理時，則利于紅火蟻的遠(yuǎn)距離擴(kuò)散，從而造成地理距離相隔較遠(yuǎn)的地區(qū)之間存在較小的遺傳距離。因此，在進(jìn)行種苗、花卉、草皮等植物性產(chǎn)品的貿(mào)易調(diào)運(yùn)時，為避免紅火蟻的傳播擴(kuò)散，一般要求不帶土。

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