豬源沙門氏菌的分離與耐藥性分析

狄文婷等

摘要：采集遼寧省大連市各大農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場鮮豬肉68份，用選擇性培養(yǎng)基SS瓊脂培養(yǎng)基分離沙門氏菌，通過菌落形態(tài)及PCR方法對分離菌株進(jìn)行鑒定，利用肉湯微量稀釋法藥敏試驗(yàn)檢測沙門氏菌對9大類15種抗生素的耐藥性。結(jié)果表明：共獲得鮮豬肉樣品沙門氏菌12株，檢出率為17.6%；91.7%鮮豬肉樣品中的沙門氏菌至少耐受1種抗菌藥，耐藥率最高的抗生素為氟苯尼考（75.0%）、鹽酸沙拉沙星（66.7%）、硫酸新霉素（66.7%）和鹽酸多西環(huán)素（667%），其次為土霉素（58.3%）、硫酸慶大霉素（58.3%）、乙酰甲喹（58.3%），耐藥率較低的有乳酸環(huán)丙沙星（500%）、恩諾沙星（50.0%）、鹽酸環(huán)丙沙星（50.0%）、硫氰酸紅霉素（41.7%）、阿莫西林（16.7%）、硫酸黏菌素（16.7%）；大連市農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場鮮豬肉的沙門氏菌檢出率較高，并且沙門氏菌對各類抗生素表現(xiàn)出了很高的耐藥性，這種高耐藥性也可能通過食物鏈傳遞給人類，應(yīng)該引起足夠重視。

關(guān)鍵詞：豬肉；沙門氏菌；耐藥性；大連

中圖分類號： R155.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0278-02

收稿日期：2013-11-07

基金項(xiàng)目：大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號：S2013010）；大連民族學(xué)院“太陽鳥項(xiàng)目”（編號：tyn13102）。

作者簡介：狄文婷（1989—），女，黑龍江齊齊哈爾人，從事食品質(zhì)量與安全研究。E-mail：942859228@qq.com。

通信作者：杜雄偉，博士，講師。E-mail：dxw@dlnu.edu.cn。沙門氏菌屬（Salmonella）是革蘭氏陰性、無芽孢、無莢膜、周身鞭毛、能運(yùn)動的需氧或兼性厭氧的短桿菌[1]。目前可以確定，除沙門氏菌活菌引起感染型中毒以外，沙門氏菌產(chǎn)生的腸毒素也是導(dǎo)致出現(xiàn)中毒癥狀的原因。沙門氏菌中毒主要是由動物性食品引起的，其中魚、乳、蛋也極易引發(fā)較嚴(yán)重的食源性疾病[2]。然而，隨著沙門氏菌被不斷研究和鑒定及其在養(yǎng)殖業(yè)中引發(fā)疾病，在養(yǎng)殖過程中為預(yù)防沙門氏菌引起的疾病，隨意給家禽、家畜投放抗菌藥，導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥菌和多重耐藥現(xiàn)象，其耐藥譜也越來越廣。因此，通過耐藥性試驗(yàn)掌握沙門氏菌的耐藥譜，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)學(xué)用藥，對食品安全具有重要意義。由于沙門氏菌及其耐藥性能夠在整個(gè)食物鏈傳遞，由食品傳遞到人，因此檢測鮮肉中的沙門氏菌，并且通過藥敏試驗(yàn)測定某種抗菌藥物對其抑菌濃度十分必要。近年來食源性沙門氏菌的鑒定檢測已經(jīng)在國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域得到重視和研究，馬國柱等[3-6]研究過陜西省、河南省的食源性沙門氏菌，其他相關(guān)研究未見報(bào)道[7]。本研究對遼寧省大連市豬源性沙門氏菌進(jìn)行分離，對9類15種抗生素進(jìn)行藥敏性分析，旨在為做好大連地區(qū)豬源性食品安全工作提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株2012年10月至2013年9月采集大連市開發(fā)區(qū)金瑪、金發(fā)地等大型農(nóng)貿(mào)市場和超市的新鮮豬肉樣品68份，分離出可疑菌株12株。對照菌株為E.coil ATCC25922。

1.1.2抗生素氯霉素類：Flo氟苯尼考（98.4%）。氨基糖苷類：Neo硫酸新霉素（696 U/mg），Gen硫酸慶大霉素（610 U/mg）。青霉素類：Amo阿莫西林（96.4%）。喹諾酮類：Nia煙酸諾氟沙星（99%），Sar鹽酸沙拉沙星（98%），CL乳酸環(huán)丙沙星（98.6%），Enr恩諾沙星（99.1%），CH鹽酸環(huán)丙沙星（98.8%）。大環(huán)內(nèi)酯類：Thi硫氰酸紅霉素（780 U/mg）。磺胺類：Sul磺胺間甲嘧啶鈉（99.2%）。多黏菌素：Col硫酸黏菌素（19 578 U/mg）。四環(huán)素類：Oxy土霉素（96.1%），Dox鹽酸多西環(huán)素（合多西環(huán)素92%）。人工合成的抗菌獸藥：Meq乙酰甲喹（99.1%）。

1.2方法

1.2.1采樣準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備封口膜若干，用乙醇棉擦拭內(nèi)部表面，達(dá)到殺菌效果；準(zhǔn)備營養(yǎng)肉湯和若干試管，將9 mL營養(yǎng)肉湯加到試管內(nèi)，塞好，并在121 ℃條件下高壓滅菌 30 min。去市場上采樣時(shí)注意雜菌污染，每份樣品用1個(gè)封口膜裝好，并標(biāo)號做相應(yīng)記錄。每次采樣完成后，打開超凈工作臺的紫外燈滅菌30 min，然后將封口膜內(nèi)的肉樣品剪成 2～3 粒黃豆大小的肉粒放到滅菌后的營養(yǎng)肉湯試管里，最后將試管放到搖床里，36 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2選擇性培養(yǎng)和增菌（1）準(zhǔn)備工作：在無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行紫外滅菌30 min，將SS培養(yǎng)基以及培養(yǎng)皿（進(jìn)行包扎）在121 ℃條件下高壓滅菌30 min；之后在無菌操作臺上傾倒培養(yǎng)基并標(biāo)號；取出搖床上的試管，在無菌操作臺上分別對應(yīng)標(biāo)號劃線接種于SS培養(yǎng)基（現(xiàn)購），在（36±1） ℃下倒置培養(yǎng)18～24 h[8]；將無菌操作臺進(jìn)行紫外滅菌30 min，將若干EP管、營養(yǎng)肉湯、移液槍頭以及牙簽包好，在121 ℃條件下高壓滅菌30 min。（2）一次增菌：在超凈臺內(nèi)用移液槍加1 mL營養(yǎng)肉湯于EP管內(nèi)，取出恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)皿，用接種針挑取單菌落接種到EP管內(nèi)；然后用封口膜包好EP管，36 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)18～24 h。（3）二次增菌：一次增菌 18～24 h 后，在無菌操作臺里用移液槍加1 mL營養(yǎng)肉湯到新滅過菌的EP管，取出搖床里的EP管，用接種環(huán)接種到新EP管里；然后將舊EP管用封口膜包好，與30%～50%甘油按照3 ∶1比例混勻，在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?；將新EP管用封口膜包好，36 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3PCR試驗(yàn)準(zhǔn)備1盆冰塊。打開水浴鍋燒到100 ℃，將蒸餾水、移液槍頭在121 ℃條件下滅菌30 min，打開無菌操作臺紫外滅菌30 min。取出二次增菌的EP管，1 000 r/min 離心3 min。取出EP管，在超凈臺里倒出上清液，用移液槍吸取200 μL無菌水于EP管內(nèi)，清洗2次。再加入200 μL無菌水。在水浴鍋內(nèi)煮10 min，然后在冰塊里冷卻5 min，最后在1萬r/min 條件下離心5 min.然后按照PCR試劑盒的要求按順序加樣，將處理好的樣品加好后放入PCR儀中，設(shè)定程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性，退火（不同引物溫度不同），72 ℃延伸，30～35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后16 ℃保存即可[9]。 PCR反應(yīng)完成后進(jìn)行電泳試驗(yàn)。凝膠板的制作：TAE×1 2 mL+瓊脂糖1 g+蒸餾水 98 mL，加熱使瓊脂糖完全融化；將液體倒入電泳槽，冷卻成型后即可。用10 μL樣品和2 μL Buffer進(jìn)行電泳試驗(yàn)點(diǎn)樣。點(diǎn)樣完成后，在U=400 V、I=95 mA、W=38、T=1 h的條件下進(jìn)行試驗(yàn)。電泳完成后在復(fù)紅染色液中浸泡30 min，在紫外燈光下觀察、照相、記錄[10]。結(jié)果沙門氏菌的條帶長度是286 bp。

1.2.4藥敏試驗(yàn)將營養(yǎng)肉湯、試管、培養(yǎng)皿、移液槍頭在121 ℃、30 min條件下滅菌；96孔板用75%乙醇進(jìn)行殺菌，再在無菌操作臺上用紫外線殺菌30 min[11]；所有藥品濃度均配制成5.12 g/L，-20 ℃保存于10 mL EP管中[12]。取1 mL藥品加入含9 mL營養(yǎng)肉湯的試管中，此時(shí)藥品濃度為512 mg/L。取20 μL菌液和約20 mL營養(yǎng)肉湯于培養(yǎng)皿中備用。96孔板中的所用孔都用移液排槍加100 μL營養(yǎng)肉湯，取100 μL的512 mg/L藥品加到96孔板第1排，攪勻，取第1排溶液100 μL加到第2排，以此類推，使最后所有孔均為100 μL。最后每孔加入100 μL菌液。此時(shí)第1排藥品濃度為128 mg/L，第2排藥品濃度為64 mg/L。以此類推，第3～12排藥品濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/L。將96孔板放在36 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h，觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1鮮豬肉樣品沙門氏菌的分離鑒定結(jié)果

本研究共獲得鮮豬肉樣品68份，分離12株沙門氏菌，分

離率為17.6%。在大連市開發(fā)區(qū)農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場，沙門氏菌表現(xiàn)出了很高的污染率，其他時(shí)間在其他農(nóng)貿(mào)市場采集的樣品未出現(xiàn)被沙門氏菌污染情況。沙門氏菌是引發(fā)食源性疾病最常見的致病菌之一，本研究結(jié)果表明，應(yīng)對市場流通的鮮肉產(chǎn)品引起高度重視。本研究中分離樣品污染沙門氏菌的主要原因有2個(gè)：其一，農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境為沙門氏菌的生長創(chuàng)造了良好條件，未經(jīng)消毒而使用的工具污染鮮肉；其二，生豬在宰殺前已經(jīng)感染沙門氏菌。從68份市場豬肉中分離12株沙門氏菌，可見市場豬肉污染十分嚴(yán)重，應(yīng)該加強(qiáng)豬肉屠宰、運(yùn)輸、加工、貯存及銷售等環(huán)節(jié)的管理，防止病原菌污染。

豬源沙門氏菌顯示了很高的耐藥性，至少可以耐受1種抗菌藥物，有的甚至可以耐受6～7種抗菌藥物，雖然耐藥率較低，但是沙門氏菌的多重耐藥已經(jīng)成為普遍現(xiàn)象。沙門氏菌的高耐藥性不止表現(xiàn)在食品、畜禽上，還會通過食物鏈傳遞到人類，使人產(chǎn)生對抗生素的耐藥性，從而加大對食源性疾病的治療難度，因此應(yīng)加強(qiáng)對食品和藥品的監(jiān)測。

參考文獻(xiàn)：

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[12]王娟，曲志娜，趙思俊，等. 禽源大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性研究[J]. 中國動物檢疫，2009，26（5）：64-65.

1.2.4藥敏試驗(yàn)將營養(yǎng)肉湯、試管、培養(yǎng)皿、移液槍頭在121 ℃、30 min條件下滅菌；96孔板用75%乙醇進(jìn)行殺菌，再在無菌操作臺上用紫外線殺菌30 min[11]；所有藥品濃度均配制成5.12 g/L，-20 ℃保存于10 mL EP管中[12]。取1 mL藥品加入含9 mL營養(yǎng)肉湯的試管中，此時(shí)藥品濃度為512 mg/L。取20 μL菌液和約20 mL營養(yǎng)肉湯于培養(yǎng)皿中備用。96孔板中的所用孔都用移液排槍加100 μL營養(yǎng)肉湯，取100 μL的512 mg/L藥品加到96孔板第1排，攪勻，取第1排溶液100 μL加到第2排，以此類推，使最后所有孔均為100 μL。最后每孔加入100 μL菌液。此時(shí)第1排藥品濃度為128 mg/L，第2排藥品濃度為64 mg/L。以此類推，第3～12排藥品濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/L。將96孔板放在36 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h，觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1鮮豬肉樣品沙門氏菌的分離鑒定結(jié)果

本研究共獲得鮮豬肉樣品68份，分離12株沙門氏菌，分

離率為17.6%。在大連市開發(fā)區(qū)農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場，沙門氏菌表現(xiàn)出了很高的污染率，其他時(shí)間在其他農(nóng)貿(mào)市場采集的樣品未出現(xiàn)被沙門氏菌污染情況。沙門氏菌是引發(fā)食源性疾病最常見的致病菌之一，本研究結(jié)果表明，應(yīng)對市場流通的鮮肉產(chǎn)品引起高度重視。本研究中分離樣品污染沙門氏菌的主要原因有2個(gè)：其一，農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境為沙門氏菌的生長創(chuàng)造了良好條件，未經(jīng)消毒而使用的工具污染鮮肉；其二，生豬在宰殺前已經(jīng)感染沙門氏菌。從68份市場豬肉中分離12株沙門氏菌，可見市場豬肉污染十分嚴(yán)重，應(yīng)該加強(qiáng)豬肉屠宰、運(yùn)輸、加工、貯存及銷售等環(huán)節(jié)的管理，防止病原菌污染。

豬源沙門氏菌顯示了很高的耐藥性，至少可以耐受1種抗菌藥物，有的甚至可以耐受6～7種抗菌藥物，雖然耐藥率較低，但是沙門氏菌的多重耐藥已經(jīng)成為普遍現(xiàn)象。沙門氏菌的高耐藥性不止表現(xiàn)在食品、畜禽上，還會通過食物鏈傳遞到人類，使人產(chǎn)生對抗生素的耐藥性，從而加大對食源性疾病的治療難度，因此應(yīng)加強(qiáng)對食品和藥品的監(jiān)測。

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1.2.4藥敏試驗(yàn)將營養(yǎng)肉湯、試管、培養(yǎng)皿、移液槍頭在121 ℃、30 min條件下滅菌；96孔板用75%乙醇進(jìn)行殺菌，再在無菌操作臺上用紫外線殺菌30 min[11]；所有藥品濃度均配制成5.12 g/L，-20 ℃保存于10 mL EP管中[12]。取1 mL藥品加入含9 mL營養(yǎng)肉湯的試管中，此時(shí)藥品濃度為512 mg/L。取20 μL菌液和約20 mL營養(yǎng)肉湯于培養(yǎng)皿中備用。96孔板中的所用孔都用移液排槍加100 μL營養(yǎng)肉湯，取100 μL的512 mg/L藥品加到96孔板第1排，攪勻，取第1排溶液100 μL加到第2排，以此類推，使最后所有孔均為100 μL。最后每孔加入100 μL菌液。此時(shí)第1排藥品濃度為128 mg/L，第2排藥品濃度為64 mg/L。以此類推，第3～12排藥品濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/L。將96孔板放在36 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h，觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1鮮豬肉樣品沙門氏菌的分離鑒定結(jié)果

本研究共獲得鮮豬肉樣品68份，分離12株沙門氏菌，分

離率為17.6%。在大連市開發(fā)區(qū)農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場，沙門氏菌表現(xiàn)出了很高的污染率，其他時(shí)間在其他農(nóng)貿(mào)市場采集的樣品未出現(xiàn)被沙門氏菌污染情況。沙門氏菌是引發(fā)食源性疾病最常見的致病菌之一，本研究結(jié)果表明，應(yīng)對市場流通的鮮肉產(chǎn)品引起高度重視。本研究中分離樣品污染沙門氏菌的主要原因有2個(gè)：其一，農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境為沙門氏菌的生長創(chuàng)造了良好條件，未經(jīng)消毒而使用的工具污染鮮肉；其二，生豬在宰殺前已經(jīng)感染沙門氏菌。從68份市場豬肉中分離12株沙門氏菌，可見市場豬肉污染十分嚴(yán)重，應(yīng)該加強(qiáng)豬肉屠宰、運(yùn)輸、加工、貯存及銷售等環(huán)節(jié)的管理，防止病原菌污染。

豬源沙門氏菌顯示了很高的耐藥性，至少可以耐受1種抗菌藥物，有的甚至可以耐受6～7種抗菌藥物，雖然耐藥率較低，但是沙門氏菌的多重耐藥已經(jīng)成為普遍現(xiàn)象。沙門氏菌的高耐藥性不止表現(xiàn)在食品、畜禽上，還會通過食物鏈傳遞到人類，使人產(chǎn)生對抗生素的耐藥性，從而加大對食源性疾病的治療難度，因此應(yīng)加強(qiáng)對食品和藥品的監(jiān)測。

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