波紋巴非蛤活性肽的體外抗氧化活性

摘要：研究波紋巴非蛤活性肽體外清除自由基的作用，以實驗室自制的波紋巴非蛤活性肽（27 406～69 000 u）為原料，測定其對羥自由基、超氧自由基、過氧化氫和亞硝酸根離子的清除能力。結果表明，當波紋巴非蛤活性肽的相對分子質量在40 000～45 000 u時，清除超氧自由基、過氧化氫、羥自由基和亞硝酸根的能力均達到最高峰。

關鍵詞：生物活性肽；波紋巴非蛤；抗氧化活性

中圖分類號： TS202.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0298-02

收稿日期：2013-12-06

基金項目：韓山師范學院青年科學基金（編號：LQ200811）。

作者簡介：林麗云（1982—），女，廣東潮州人，碩士，實驗師，從事食品生物技術研究。E-mail：leayun_lin@126.com。抗氧化劑能夠保護食物免受氧化損傷而變質，并且在人體的消化道內具有抗氧化作用，可以防止消化道發(fā)生氧化損傷；被人體吸收后，抗氧化劑可在機體其他組織器官內發(fā)揮作用。天然抗氧化劑具有較強的抗氧化活性和良好的食用安全性，因此在食品、保健品、藥品等領域已經(jīng)展現(xiàn)出良好的應用前景。隨著海洋生物研究的深入和研究技術的提高，從海洋生物中尋找新的天然抗氧化劑已經(jīng)成為海洋食品、藥物、保健品研究的重要目標之一。

波紋巴非蛤（俗稱花甲）是我國重要的海洋貝類資源，營養(yǎng)豐富、肉質鮮美，同時具有很高的食療和藥用價值。本試驗以筆者所在實驗室自制的波紋巴非蛤活性肽為原料，通過測定波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根、過氧化氫、超氧自由基和羥自由基4種物質的能力，以期測定其抗氧化活性，從而進一步檢驗波紋巴非蛤活性肽的抗氧化能力，以期為波紋巴非蛤活性肽的后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

波紋巴非蛤活性肽，為筆者所在實驗室自制。

主要試劑有茚三酮、酚酞、羅丹明B液、H2SO4、FeSO4、鄰苯三酚、Tis-HCl緩沖溶液（pH值8.0）、濃鹽酸、丙酮、NaNO2 標準溶液、0.01 mol/L藏紅T溶液、靛藍胭脂紅、銅（Ⅱ）溶液等，均為分析純。

1.2試驗儀器

UV-2102/PC/PCS型紫外分光光度計，上海尤尼科儀器有限公司；pHS-3C精密酸度計，上海虹益儀器有限公司；KA-1000飛鴿牌高速離心機；氣浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；分析天平，潮州凱譽生物有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1波紋巴非蛤活性肽清除羥自由基（·HO）的能力

1.3.1.1羥自由基的測定取2支10 mL的刻度試管，在1支管中分別加入2.5 mL羅丹明B液、0.8 mL硫酸溶液、1.5 mL FeSO4溶液、1.0 mL H2O2溶液，加蒸餾水稀釋至刻度處，搖勻并放置5 min后，置于1 cm比色皿中，用紫外分光光度計測定其吸收峰，確定其最大吸收波長為558 nm。然后用紫外分光光度計在558 nm處測定吸光度，計算其與空白參比的吸光度之差ΔD羥自由基。

1.3.1.2羥自由基清除率的測定在10 mL具塞刻度試管中依次加入2.5 mL羅丹明B溶液、0.8 mL硫酸溶液、1.5 mL FeSO4溶液、1.0 mL H2O2溶液，搖勻并放置5 min后，加入 1 mL 波紋巴非蛤活性肽溶液（濃度10 mg/mL），加蒸餾水稀釋至刻度處，測定其吸光度D1；對照以溶劑代替，其余步驟同上，測定對照蒸餾水吸光度D對照1、空白體系（羅丹明B和H2SO4溶液）吸光度D空白1，計算清除率P1[1-6]：

P1=D1-D對照1D空白1-D對照1×100%。

1.3.2波紋巴非蛤活性肽清除超氧自由基能力的測定取5 mL 0.05 mol/L（pH值 8.0）的 Tis-HCl緩沖溶液，置于 25 ℃ 水浴中預熱20 min，然后分別加入波紋巴非蛤活性肽樣品液（蛋白濃度10 mg/mL）和0.4 mL 25 mol/L鄰苯三酚溶液，混勻后置于25 ℃水浴中反應4 min，再加入8 mol/L HCl終止反應，于299 nm處測定溶液的吸光度（D2）?？瞻讓φ战M以相同體積的丙酮代替待測樣品，測定吸光度D空白2，計算清除率P2[2，5]：

P2=D空白2-D2D空白2×100%。

1.3.3波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根離子能力的測定

2.2波紋巴非蛤活性肽對超氧自由基離子的清除率

由圖2可知，波紋巴非蛤活性肽具有較強的清除超氧自由基離子的能力，清除效果明顯，當相對分子質量在 43 000 u 左右時，達到最高峰，清除率達74%。

2.3波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根離子的能力

由圖3可知，波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根離子的能力較弱，相對分子質量在31 000～54 000 u時，清除率在10%以上；相對分子質量在43 000 u左右時，達到最高峰，清除率達25%。

2.4波紋巴非蛤活性肽清除過氧化氫離子的能力

由圖4可知，波紋巴非蛤活性肽清除過氧化氫離子的能力強，各階段的清除率均在10%以上，相對分子質量在 43 000 u 左右時達到最高峰，清除率在60%以上。

2.5波紋巴非蛤活性肽清除4種離子的能力對比

由圖5可知，波紋巴非蛤活性肽清除各種離子的能力為：超氧自由基>過氧化氫>羥自由基>亞硝酸根。波紋巴非蛤多肽液的相對分子質量在40 000～45 000 u時，清除4種離子的能力最強；當相對分子質量小于40 000 u時，隨著相對分子質量的增大，抗氧化活性增大；當相對分子質量大于 45 000 u 時，隨著相對分子質量的增大，抗氧化活性減小。

3結論

波紋巴非蛤活性肽應用于體外清除自由基的試驗中效果

明顯。波紋巴非蛤活性肽對超氧自由基清除率最高達74%，對過氧化氫清除率最高達61.5%，對羥自由基清除率最高達45%，對亞硝酸根離子的清除率最高達24%。當波紋巴非蛤活性肽分子量在40 000～45 000 u時，其清除超氧自由基、過氧化氫、羥自由基和亞硝酸根的能力均達到最大。

參考文獻：

[1]范秀萍，吳紅棉，王婭楠，等. 波紋巴非蛤糖蛋白的分離提取及體外清除羥自由基活性的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（1）：138-140.

[2]楊永芳，楊最素，丁國芳，等. 菲律賓蛤仔酶解寡肽的分離及體外抗氧化作用研究[J]. 中華中醫(yī)藥學刊，2011，29（5）：1069-1072.

[3]郁迪，許新建，楊最素，等. 菲律賓蛤仔木瓜蛋白酶水解物抗氧化活性研究[J]. 浙江海洋學院學報：自然科學版，2011，30（6）：515-519.

[4]白林山，王獻釗，李津晶. 靛藍胭脂紅-銅（Ⅱ）體系催化光度法測定雨水中微量過氧化氫[J]. 安徽工業(yè)大學學報：自然科學版，2007，24（2）：159-162.

[5]游麗君. 泥鰍蛋白抗氧化肽的分離純化及抗疲勞、抗癌功效研究[D]. 廣州：華南理工大學，2010：64-70.

[6]閻欲曉，粟桂嬌，李小梅，等. 文蛤蛋白抗氧化活性肽的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2007，28（12）：121-123.

摘要：研究波紋巴非蛤活性肽體外清除自由基的作用，以實驗室自制的波紋巴非蛤活性肽（27 406～69 000 u）為原料，測定其對羥自由基、超氧自由基、過氧化氫和亞硝酸根離子的清除能力。結果表明，當波紋巴非蛤活性肽的相對分子質量在40 000～45 000 u時，清除超氧自由基、過氧化氫、羥自由基和亞硝酸根的能力均達到最高峰。

關鍵詞：生物活性肽；波紋巴非蛤；抗氧化活性

中圖分類號： TS202.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0298-02

收稿日期：2013-12-06

基金項目：韓山師范學院青年科學基金（編號：LQ200811）。

作者簡介：林麗云（1982—），女，廣東潮州人，碩士，實驗師，從事食品生物技術研究。E-mail：leayun_lin@126.com?？寡趸瘎┠軌虮Ｗo食物免受氧化損傷而變質，并且在人體的消化道內具有抗氧化作用，可以防止消化道發(fā)生氧化損傷；被人體吸收后，抗氧化劑可在機體其他組織器官內發(fā)揮作用。天然抗氧化劑具有較強的抗氧化活性和良好的食用安全性，因此在食品、保健品、藥品等領域已經(jīng)展現(xiàn)出良好的應用前景。隨著海洋生物研究的深入和研究技術的提高，從海洋生物中尋找新的天然抗氧化劑已經(jīng)成為海洋食品、藥物、保健品研究的重要目標之一。

波紋巴非蛤（俗稱花甲）是我國重要的海洋貝類資源，營養(yǎng)豐富、肉質鮮美，同時具有很高的食療和藥用價值。本試驗以筆者所在實驗室自制的波紋巴非蛤活性肽為原料，通過測定波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根、過氧化氫、超氧自由基和羥自由基4種物質的能力，以期測定其抗氧化活性，從而進一步檢驗波紋巴非蛤活性肽的抗氧化能力，以期為波紋巴非蛤活性肽的后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

波紋巴非蛤活性肽，為筆者所在實驗室自制。

主要試劑有茚三酮、酚酞、羅丹明B液、H2SO4、FeSO4、鄰苯三酚、Tis-HCl緩沖溶液（pH值8.0）、濃鹽酸、丙酮、NaNO2 標準溶液、0.01 mol/L藏紅T溶液、靛藍胭脂紅、銅（Ⅱ）溶液等，均為分析純。

1.2試驗儀器

UV-2102/PC/PCS型紫外分光光度計，上海尤尼科儀器有限公司；pHS-3C精密酸度計，上海虹益儀器有限公司；KA-1000飛鴿牌高速離心機；氣浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；分析天平，潮州凱譽生物有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1波紋巴非蛤活性肽清除羥自由基（·HO）的能力

1.3.1.1羥自由基的測定取2支10 mL的刻度試管，在1支管中分別加入2.5 mL羅丹明B液、0.8 mL硫酸溶液、1.5 mL FeSO4溶液、1.0 mL H2O2溶液，加蒸餾水稀釋至刻度處，搖勻并放置5 min后，置于1 cm比色皿中，用紫外分光光度計測定其吸收峰，確定其最大吸收波長為558 nm。然后用紫外分光光度計在558 nm處測定吸光度，計算其與空白參比的吸光度之差ΔD羥自由基。

1.3.1.2羥自由基清除率的測定在10 mL具塞刻度試管中依次加入2.5 mL羅丹明B溶液、0.8 mL硫酸溶液、1.5 mL FeSO4溶液、1.0 mL H2O2溶液，搖勻并放置5 min后，加入 1 mL 波紋巴非蛤活性肽溶液（濃度10 mg/mL），加蒸餾水稀釋至刻度處，測定其吸光度D1；對照以溶劑代替，其余步驟同上，測定對照蒸餾水吸光度D對照1、空白體系（羅丹明B和H2SO4溶液）吸光度D空白1，計算清除率P1[1-6]：

P1=D1-D對照1D空白1-D對照1×100%。

1.3.2波紋巴非蛤活性肽清除超氧自由基能力的測定取5 mL 0.05 mol/L（pH值 8.0）的 Tis-HCl緩沖溶液，置于 25 ℃ 水浴中預熱20 min，然后分別加入波紋巴非蛤活性肽樣品液（蛋白濃度10 mg/mL）和0.4 mL 25 mol/L鄰苯三酚溶液，混勻后置于25 ℃水浴中反應4 min，再加入8 mol/L HCl終止反應，于299 nm處測定溶液的吸光度（D2）。空白對照組以相同體積的丙酮代替待測樣品，測定吸光度D空白2，計算清除率P2[2，5]：

P2=D空白2-D2D空白2×100%。

1.3.3波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根離子能力的測定

2.2波紋巴非蛤活性肽對超氧自由基離子的清除率

由圖2可知，波紋巴非蛤活性肽具有較強的清除超氧自由基離子的能力，清除效果明顯，當相對分子質量在 43 000 u 左右時，達到最高峰，清除率達74%。

2.3波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根離子的能力

由圖3可知，波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根離子的能力較弱，相對分子質量在31 000～54 000 u時，清除率在10%以上；相對分子質量在43 000 u左右時，達到最高峰，清除率達25%。

2.4波紋巴非蛤活性肽清除過氧化氫離子的能力

由圖4可知，波紋巴非蛤活性肽清除過氧化氫離子的能力強，各階段的清除率均在10%以上，相對分子質量在 43 000 u 左右時達到最高峰，清除率在60%以上。

2.5波紋巴非蛤活性肽清除4種離子的能力對比

由圖5可知，波紋巴非蛤活性肽清除各種離子的能力為：超氧自由基>過氧化氫>羥自由基>亞硝酸根。波紋巴非蛤多肽液的相對分子質量在40 000～45 000 u時，清除4種離子的能力最強；當相對分子質量小于40 000 u時，隨著相對分子質量的增大，抗氧化活性增大；當相對分子質量大于 45 000 u 時，隨著相對分子質量的增大，抗氧化活性減小。

3結論

波紋巴非蛤活性肽應用于體外清除自由基的試驗中效果

明顯。波紋巴非蛤活性肽對超氧自由基清除率最高達74%，對過氧化氫清除率最高達61.5%，對羥自由基清除率最高達45%，對亞硝酸根離子的清除率最高達24%。當波紋巴非蛤活性肽分子量在40 000～45 000 u時，其清除超氧自由基、過氧化氫、羥自由基和亞硝酸根的能力均達到最大。

參考文獻：

[1]范秀萍，吳紅棉，王婭楠，等. 波紋巴非蛤糖蛋白的分離提取及體外清除羥自由基活性的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（1）：138-140.

[2]楊永芳，楊最素，丁國芳，等. 菲律賓蛤仔酶解寡肽的分離及體外抗氧化作用研究[J]. 中華中醫(yī)藥學刊，2011，29（5）：1069-1072.

[3]郁迪，許新建，楊最素，等. 菲律賓蛤仔木瓜蛋白酶水解物抗氧化活性研究[J]. 浙江海洋學院學報：自然科學版，2011，30（6）：515-519.

[4]白林山，王獻釗，李津晶. 靛藍胭脂紅-銅（Ⅱ）體系催化光度法測定雨水中微量過氧化氫[J]. 安徽工業(yè)大學學報：自然科學版，2007，24（2）：159-162.

[5]游麗君. 泥鰍蛋白抗氧化肽的分離純化及抗疲勞、抗癌功效研究[D]. 廣州：華南理工大學，2010：64-70.

[6]閻欲曉，粟桂嬌，李小梅，等. 文蛤蛋白抗氧化活性肽的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2007，28（12）：121-123.

摘要：研究波紋巴非蛤活性肽體外清除自由基的作用，以實驗室自制的波紋巴非蛤活性肽（27 406～69 000 u）為原料，測定其對羥自由基、超氧自由基、過氧化氫和亞硝酸根離子的清除能力。結果表明，當波紋巴非蛤活性肽的相對分子質量在40 000～45 000 u時，清除超氧自由基、過氧化氫、羥自由基和亞硝酸根的能力均達到最高峰。

關鍵詞：生物活性肽；波紋巴非蛤；抗氧化活性

中圖分類號： TS202.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0298-02

收稿日期：2013-12-06

基金項目：韓山師范學院青年科學基金（編號：LQ200811）。

作者簡介：林麗云（1982—），女，廣東潮州人，碩士，實驗師，從事食品生物技術研究。E-mail：leayun_lin@126.com?？寡趸瘎┠軌虮Ｗo食物免受氧化損傷而變質，并且在人體的消化道內具有抗氧化作用，可以防止消化道發(fā)生氧化損傷；被人體吸收后，抗氧化劑可在機體其他組織器官內發(fā)揮作用。天然抗氧化劑具有較強的抗氧化活性和良好的食用安全性，因此在食品、保健品、藥品等領域已經(jīng)展現(xiàn)出良好的應用前景。隨著海洋生物研究的深入和研究技術的提高，從海洋生物中尋找新的天然抗氧化劑已經(jīng)成為海洋食品、藥物、保健品研究的重要目標之一。

波紋巴非蛤（俗稱花甲）是我國重要的海洋貝類資源，營養(yǎng)豐富、肉質鮮美，同時具有很高的食療和藥用價值。本試驗以筆者所在實驗室自制的波紋巴非蛤活性肽為原料，通過測定波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根、過氧化氫、超氧自由基和羥自由基4種物質的能力，以期測定其抗氧化活性，從而進一步檢驗波紋巴非蛤活性肽的抗氧化能力，以期為波紋巴非蛤活性肽的后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

波紋巴非蛤活性肽，為筆者所在實驗室自制。

主要試劑有茚三酮、酚酞、羅丹明B液、H2SO4、FeSO4、鄰苯三酚、Tis-HCl緩沖溶液（pH值8.0）、濃鹽酸、丙酮、NaNO2 標準溶液、0.01 mol/L藏紅T溶液、靛藍胭脂紅、銅（Ⅱ）溶液等，均為分析純。

1.2試驗儀器

UV-2102/PC/PCS型紫外分光光度計，上海尤尼科儀器有限公司；pHS-3C精密酸度計，上海虹益儀器有限公司；KA-1000飛鴿牌高速離心機；氣浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；分析天平，潮州凱譽生物有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1波紋巴非蛤活性肽清除羥自由基（·HO）的能力

1.3.1.1羥自由基的測定取2支10 mL的刻度試管，在1支管中分別加入2.5 mL羅丹明B液、0.8 mL硫酸溶液、1.5 mL FeSO4溶液、1.0 mL H2O2溶液，加蒸餾水稀釋至刻度處，搖勻并放置5 min后，置于1 cm比色皿中，用紫外分光光度計測定其吸收峰，確定其最大吸收波長為558 nm。然后用紫外分光光度計在558 nm處測定吸光度，計算其與空白參比的吸光度之差ΔD羥自由基。

1.3.1.2羥自由基清除率的測定在10 mL具塞刻度試管中依次加入2.5 mL羅丹明B溶液、0.8 mL硫酸溶液、1.5 mL FeSO4溶液、1.0 mL H2O2溶液，搖勻并放置5 min后，加入 1 mL 波紋巴非蛤活性肽溶液（濃度10 mg/mL），加蒸餾水稀釋至刻度處，測定其吸光度D1；對照以溶劑代替，其余步驟同上，測定對照蒸餾水吸光度D對照1、空白體系（羅丹明B和H2SO4溶液）吸光度D空白1，計算清除率P1[1-6]：

P1=D1-D對照1D空白1-D對照1×100%。

1.3.2波紋巴非蛤活性肽清除超氧自由基能力的測定取5 mL 0.05 mol/L（pH值 8.0）的 Tis-HCl緩沖溶液，置于 25 ℃ 水浴中預熱20 min，然后分別加入波紋巴非蛤活性肽樣品液（蛋白濃度10 mg/mL）和0.4 mL 25 mol/L鄰苯三酚溶液，混勻后置于25 ℃水浴中反應4 min，再加入8 mol/L HCl終止反應，于299 nm處測定溶液的吸光度（D2）。空白對照組以相同體積的丙酮代替待測樣品，測定吸光度D空白2，計算清除率P2[2，5]：

P2=D空白2-D2D空白2×100%。

1.3.3波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根離子能力的測定

2.2波紋巴非蛤活性肽對超氧自由基離子的清除率

由圖2可知，波紋巴非蛤活性肽具有較強的清除超氧自由基離子的能力，清除效果明顯，當相對分子質量在 43 000 u 左右時，達到最高峰，清除率達74%。

2.3波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根離子的能力

由圖3可知，波紋巴非蛤活性肽清除亞硝酸根離子的能力較弱，相對分子質量在31 000～54 000 u時，清除率在10%以上；相對分子質量在43 000 u左右時，達到最高峰，清除率達25%。

2.4波紋巴非蛤活性肽清除過氧化氫離子的能力

由圖4可知，波紋巴非蛤活性肽清除過氧化氫離子的能力強，各階段的清除率均在10%以上，相對分子質量在 43 000 u 左右時達到最高峰，清除率在60%以上。

2.5波紋巴非蛤活性肽清除4種離子的能力對比

由圖5可知，波紋巴非蛤活性肽清除各種離子的能力為：超氧自由基>過氧化氫>羥自由基>亞硝酸根。波紋巴非蛤多肽液的相對分子質量在40 000～45 000 u時，清除4種離子的能力最強；當相對分子質量小于40 000 u時，隨著相對分子質量的增大，抗氧化活性增大；當相對分子質量大于 45 000 u 時，隨著相對分子質量的增大，抗氧化活性減小。

3結論

波紋巴非蛤活性肽應用于體外清除自由基的試驗中效果

明顯。波紋巴非蛤活性肽對超氧自由基清除率最高達74%，對過氧化氫清除率最高達61.5%，對羥自由基清除率最高達45%，對亞硝酸根離子的清除率最高達24%。當波紋巴非蛤活性肽分子量在40 000～45 000 u時，其清除超氧自由基、過氧化氫、羥自由基和亞硝酸根的能力均達到最大。

參考文獻：

[1]范秀萍，吳紅棉，王婭楠，等. 波紋巴非蛤糖蛋白的分離提取及體外清除羥自由基活性的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（1）：138-140.

[2]楊永芳，楊最素，丁國芳，等. 菲律賓蛤仔酶解寡肽的分離及體外抗氧化作用研究[J]. 中華中醫(yī)藥學刊，2011，29（5）：1069-1072.

[3]郁迪，許新建，楊最素，等. 菲律賓蛤仔木瓜蛋白酶水解物抗氧化活性研究[J]. 浙江海洋學院學報：自然科學版，2011，30（6）：515-519.

[4]白林山，王獻釗，李津晶. 靛藍胭脂紅-銅（Ⅱ）體系催化光度法測定雨水中微量過氧化氫[J]. 安徽工業(yè)大學學報：自然科學版，2007，24（2）：159-162.

[5]游麗君. 泥鰍蛋白抗氧化肽的分離純化及抗疲勞、抗癌功效研究[D]. 廣州：華南理工大學，2010：64-70.

[6]閻欲曉，粟桂嬌，李小梅，等. 文蛤蛋白抗氧化活性肽的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2007，28（12）：121-123.