于淼等

摘要：從寧夏回族自治區(qū)賀蘭山高鹽堿地區(qū)采集的麻黃樣本中分離得到7株內(nèi)生真菌，體外抗氧化活性測(cè)定表明，所分離到的內(nèi)生真菌中有5株具有較高的抑制羥基自由基能力；有5株菌的發(fā)酵液具有中等強(qiáng)度的總抗氧化能力。在抗菌活性測(cè)定中，所分離到的7株麻黃內(nèi)生真菌對(duì)細(xì)菌指示菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出一定的抑菌作用，但對(duì)真菌指示菌炭疽桿菌和黑曲霉均未檢測(cè)到抑菌活性。

關(guān)鍵詞：麻黃（Ephedra sinica）；內(nèi)生真菌；抗菌活性；抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S432 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）18-4482-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.023

自1898年Vogl從黑麥草（Lolium temulentum L.）種子內(nèi)將第一株內(nèi)生真菌分離出來(lái)至今，已有100多年的歷史，但是最近20年才正式開(kāi)展藥用植物內(nèi)生真菌的研究[1]。1993年美國(guó)Montana州大學(xué)植物病理系博士Stierle等分離紅豆杉韌皮部的內(nèi)生真菌，得到產(chǎn)生化合產(chǎn)物紫杉醇的內(nèi)生真菌[2]。該類(lèi)菌株的發(fā)現(xiàn)使得微生物學(xué)者的目光都放在植物，特別是藥用植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物研究上。這類(lèi)研究使得目前致病菌對(duì)抗生素的耐藥性蔓延起到了至關(guān)重要的改善作用。

在自然界存在很多極端環(huán)境，如高鹽、高堿、高酸、高干旱、高壓以至高濃度重金屬離子和低營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境為一般生物生長(zhǎng)和存活的極限，但卻能生長(zhǎng)著相應(yīng)的、能適應(yīng)這些極端環(huán)境的植物和微生物。這些生物經(jīng)長(zhǎng)期自然選擇，具備了較強(qiáng)且穩(wěn)定的特殊結(jié)構(gòu)、機(jī)能和遺傳基因，以應(yīng)答強(qiáng)烈的限制因子[3]。寧夏回族自治區(qū)位于西北地區(qū)東部、黃河中上游，地處中溫帶半干旱、干旱區(qū)，降水稀少（平均年降水量292 mm），蒸發(fā)強(qiáng)烈（水面蒸發(fā)量1 296 mm），當(dāng)?shù)厮Y源總量為1 117億m3，僅占全國(guó)水資源總量的0.104%。近年來(lái)，引黃灌區(qū)的土壤鹽漬化問(wèn)題受到了寧夏自治區(qū)的高度關(guān)注，銀川北部地區(qū)鹽堿地已占總耕地面積的49%以上[4]。所以，寧夏賀蘭山地區(qū)的土地鹽堿化程度高，本試驗(yàn)選取該地區(qū)高鹽堿環(huán)境下生長(zhǎng)的麻黃作為極端環(huán)境下的研究樣本。

木賊麻黃（E.equisetina Bunge）、草麻黃（E.sinica Stapf）和中麻黃（E.intermedia Schrenk ex Mey）主要被《中國(guó)藥典》1985年版收載作為藥用的麻黃植物。從麻黃的作用和功效上看，其具有利水消腫、宣肺平喘、發(fā)汗散寒等功效，在中醫(yī)醫(yī)學(xué)上受到廣泛地利用[5]。本研究以寧夏回族自治區(qū)鹽堿地生長(zhǎng)的草麻黃為樣本，對(duì)麻黃根、莖、葉分別進(jìn)行了內(nèi)生真菌的分離、純化，并對(duì)得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行了抗菌活性、抗氧化活性的測(cè)定。對(duì)極端環(huán)境下藥用植物內(nèi)生真菌的研究，探討在外界惡劣環(huán)境下，植物與內(nèi)生真菌之間協(xié)同抵御環(huán)境影響的關(guān)系，并期望從中分離篩選出具有高生物活性的內(nèi)生真菌菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

選取寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭山區(qū)采集的麻黃。采集時(shí)間為2014年4～5月。采集麻黃新鮮枝葉，以體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇擦拭表面后裝入保鮮袋，4 ℃封存。

1.2 指示菌

抗菌試驗(yàn)指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphalococcus aureus）、炭疽桿菌（Bacillus anthraci）、黑曲霉（Aspergillus niger），均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌懸液。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，加去離子水煮沸30 min，8層紗布過(guò)濾，濾液加入葡萄糖20 g，去離子水定容至1 000 mL，并加入2%～2.5%的瓊脂制成固體培養(yǎng)基。121 ℃高壓滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）：去皮馬鈴薯200 g，加去離子水煮沸30 min，8層紗布過(guò)濾，濾液加入葡萄糖20 g，去離子水定容至1 000 mL。121 ℃高壓滅菌30 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g，加入去離子水定容至1 000 mL，校正pH至7.2～7.4。121 ℃高壓滅菌30 min。

1.4 儀器與設(shè)備

ZSD-1160全自動(dòng)新型生化培養(yǎng)箱、KYC-11021C恒溫培養(yǎng)搖床、臺(tái)式高速冷卻離心機(jī)、T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）、Multicontrol12L/18L型高壓滅菌鍋、PB303-E電子天平（METTLER-TOLEDO儀器公司）、北京長(zhǎng)源水浴控溫儀（北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）、R201D-11旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、超凈工作臺(tái)、試管、燒杯、錐形瓶。

2 試驗(yàn)方法

2.1 內(nèi)生真菌的分離

試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[6～9]，將采集來(lái)的麻黃置于水槽中用流動(dòng)水沖洗5 min，將麻黃置于濾紙上自然風(fēng)干。將風(fēng)干的麻黃分為根、莖、葉三部分，分別剪成大小為2～3 cm的組織塊，在超凈工作臺(tái)再將樣品剪成0.5 cm×0.5 cm大小，并用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡1 min，去離子水漂洗2次；在2.5%的次氯酸溶液中浸泡2 min，去離子水漂洗3次。置于濾紙上風(fēng)干后，接種于含有磷酸慶大霉素的PDA培養(yǎng)基中（每皿3～4個(gè)組織塊）。置于恒溫培養(yǎng)箱中，28～30 ℃培養(yǎng)5～7 d，12 h觀察一次，48 h內(nèi)長(zhǎng)出的菌絲，均用無(wú)菌解剖刀連培養(yǎng)基切去。48 h后，將組織塊邊緣菌絲挑至另外PDA斜面進(jìn)行分離培養(yǎng)，保種。

2.2 內(nèi)生真菌的純化

將分離出的菌種再次進(jìn)行恒溫培養(yǎng)（此次培養(yǎng)基中不加磷酸慶大霉素），28～30 ℃培養(yǎng)5～7 d，48 h后將長(zhǎng)出的菌落邊緣菌絲挑至新配制的PDA培養(yǎng)基中。進(jìn)行3～4次重復(fù)培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后將菌種挑至斜面進(jìn)行保種。

2.3 內(nèi)生真菌的發(fā)酵

將上述經(jīng)純化的內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基中活化（28～30 ℃），5 d后配制液體培養(yǎng)基PDB，將經(jīng)活化的內(nèi)生真菌單個(gè)菌落的1/4用無(wú)菌解剖刀連培養(yǎng)基切下，放入PDB中，置于恒溫?fù)u床進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)間為14 d。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液經(jīng)8層紗布過(guò)濾，以8 000 r/min速度離心10 min。離心結(jié)束后，取上清液進(jìn)行旋蒸，冷卻至室溫后置于洗凈的錐形瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 抗氧化活性的測(cè)定

2.4.1 抑制羥自由基能力測(cè)定 根據(jù)Fenton反應(yīng)測(cè)定樣品對(duì)羥自由基的抑制作用。采用南京建成公司生產(chǎn)的羥自由基測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：A018 50T/48樣），依據(jù)其說(shuō)明配制應(yīng)用液。應(yīng)用液在37 ℃水浴中預(yù)溫3 min，并在水浴鍋中完成空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、對(duì)照管和測(cè)定管的添加工作?；靹颍?7 ℃反應(yīng)1 min（以秒表計(jì)時(shí)），加入顯色劑終止反應(yīng)，一次做一支試管。再次混勻后室溫放置20 min，而后以波長(zhǎng)550 nm，1 cm光徑，去離子水調(diào)零，測(cè)定各管的吸光值。

抑制羥自由基能力（U/mL）

=■×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（8.824 mmol/L）×■×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

2.4.2 總抗氧化活性測(cè)定 機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì)，能將Fe3+還原成為Fe2+，后者可與斐林類(lèi)物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物。采用南京建成公司生產(chǎn)的總抗氧化（T-AOC）測(cè)定試劑盒，依據(jù)說(shuō)明書(shū)配制應(yīng)用液。按要求加入相應(yīng)的應(yīng)用液，充分混勻后，37 ℃水浴30 min，向測(cè)定管和對(duì)照管中加入內(nèi)生真菌發(fā)酵液。再次混勻后放置10 min，而后以波長(zhǎng)520 nm，1 cm光徑，去離子水調(diào)零，測(cè)定各管的吸光值。

總抗氧化能力（U/mL）=

■×■×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

2.5 抗菌活性的測(cè)定

取濾紙，用打孔器將濾紙打成直徑約0.5 cm的濾紙片，經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后備用。取本實(shí)驗(yàn)室保存的指示菌大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、炭疽桿菌（Bacillus anthraci）、黑曲霉（Aspergillus nige）進(jìn)行活化培養(yǎng)，將經(jīng)活化的指示菌接種于培養(yǎng)基中，并在接種位置附近放置經(jīng)內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡的濾紙片。恒溫培養(yǎng)24 h后，測(cè)量濾紙片邊緣產(chǎn)生的抑菌圈大小。

3 結(jié)果與分析

3.1 麻黃內(nèi)生真菌的分離

用組織切片培養(yǎng)法從麻黃組織的葉片內(nèi)、莖和根部中共分離得到7株內(nèi)生真菌，其中葉片內(nèi)分離出2株、莖4株、根部1株。本試驗(yàn)分離到的麻黃內(nèi)生真菌數(shù)量較少，可能是由于麻黃生長(zhǎng)環(huán)境特殊所致；也可能是由于前期植物樣品經(jīng)消毒、滅菌的時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)于徹底導(dǎo)致。

3.1 抗氧化活性測(cè)定

3.1.1 抑制羥基自由基能力 經(jīng)羥基自由基測(cè)定試劑盒測(cè)定，7株麻黃內(nèi)生真菌發(fā)酵液經(jīng)稀釋20倍后抑制羥基自由基的能力如表1所示。

用相同方法測(cè)得維生素C的抑制羥基自由基能力為908.47 U/mL。與維生素C的抑制羥基自由基能力相比較，7種內(nèi)生真菌發(fā)酵液中，除3號(hào)和6號(hào)抑制羥基自由基能力弱以外，其余5株麻黃內(nèi)生真菌發(fā)酵液均具有較高的抑制羥基自由基能力。

3.1.2 總抗氧化測(cè)定 經(jīng)總抗氧化（T-AOC）測(cè)定試劑盒測(cè)定，7株麻黃內(nèi)生真菌發(fā)酵液總抗氧化能力如表2所示。

用相同方法計(jì)算維生素C的總抗氧化能力為43.78 U/mL。由表2可知，7種內(nèi)生真菌發(fā)酵液中，2號(hào)和6號(hào)菌株發(fā)酵液的總抗氧化能力較弱，其余5株麻黃內(nèi)生真菌具有中等強(qiáng)度的總抗氧化活性。

3.2 抗菌活性測(cè)定

以金黃色葡萄球菌（SA）、大腸桿菌（EC）、炭疽桿菌（BA）、黑曲霉（AN）作為指示菌，采用濾紙片法對(duì)分離的7株麻黃內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性測(cè)定。抑菌結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，在7株供試菌中，對(duì)細(xì)菌類(lèi)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用，但對(duì)真菌類(lèi)的炭疽桿菌和黑曲霉均無(wú)抑菌作用。其中有5株對(duì)金黃色葡萄球菌顯示出了較強(qiáng)的抗菌活性。

4 小結(jié)與討論

中國(guó)中草藥資源豐富，使用年代久遠(yuǎn)，中草藥是具有價(jià)值的藥用資源[10]。麻黃作為一種傳統(tǒng)的中藥材在民間和中醫(yī)中廣泛采用。本研究選取寧夏回族自治區(qū)賀蘭山鹽堿化較重地區(qū)生長(zhǎng)的麻黃作為試驗(yàn)材料，分離得到7株內(nèi)生真菌。在麻黃內(nèi)生真菌的抗氧化活性測(cè)定中，選取抗氧化活性較強(qiáng)的維生素C作為陽(yáng)性對(duì)比，有5株顯示出中等強(qiáng)度的總抗氧化活性，5株顯示出較強(qiáng)抑制羥自由基能力。樣品的抗菌活性分析中，濾紙片法測(cè)定結(jié)果顯示，各株麻黃內(nèi)生真菌對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等細(xì)菌具有一定的抑菌活性，但對(duì)炭疽桿菌和黑曲霉等真菌無(wú)抑菌作用。

本研究對(duì)寧夏回族自治區(qū)鹽堿化地區(qū)生長(zhǎng)的藥用植物麻黃進(jìn)行了內(nèi)生真菌的初步分離，并對(duì)其生物活性進(jìn)行了初步探討，為藥用植物內(nèi)生真菌的研究添加了植物樣本。同時(shí)，對(duì)內(nèi)生真菌生物活性研究為從特殊生境的藥用植物中得到結(jié)構(gòu)新穎的藥物先導(dǎo)化合物奠定了基礎(chǔ)，對(duì)藥用植物的保護(hù)與合理開(kāi)發(fā)利用意義重大。

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