陳志勝，王丙云，冼瓊珍，陳勝鋒，計(jì)慧琴，何永明

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東佛山528231）

從中藥中提取、分離有效成分，并采用分子生物學(xué)研究手段來研究其藥物分子結(jié)構(gòu)與抗病毒分子機(jī)理間的關(guān)系，尋找出有效的抗病毒藥物是一個(gè)研究熱點(diǎn)?？共《局兴幹兄饕挠行С煞钟卸嗵穷悺⒃碥疹?、黃酮類和生物堿類等［1-3］。在本研究室前期工作中篩選到了多種對(duì)PRRSV有效的抗病毒中藥［4-5］，現(xiàn)擬對(duì)其中三種中藥的活性成分的抗病毒作用做進(jìn)一步的研究，其中穿心蓮內(nèi)酯是中藥穿心蓮的主要成分之一，是二萜內(nèi)酯類化合物，具有解熱、抗炎、抗菌、抗病毒等功效［6］。蘆根多糖具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可以清除生物體內(nèi)自由基，同時(shí)具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒作用［7］。夏枯草多糖有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等生物活性［8］。研究考察這些中藥有效成分體外抗PRRSV藥效以及細(xì)胞毒性，為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制以便更好地為獸醫(yī)臨床提供有效的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Marc-145細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，以DMEM（Hyclone）添加10%胎牛血清（Hyclone）以及雙抗（青、鏈霉素終含量均為100 IU／mL）完全培養(yǎng)液培養(yǎng)單層備用；PRRSV經(jīng)典毒株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)，采用 Reed-Muench兩氏法測(cè)定 PRRSV對(duì)Marc-145的半數(shù)感染劑量（TCID50）為 10-5／mL。

1.2 中藥提取液的制備 穿心蓮內(nèi)酯鹽由廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院438實(shí)驗(yàn)室提供，為穿心蓮內(nèi)酯的亞硫酸氫鈉加成物，初始液濃度為5.0 mg／mL。采用酶法從蘆根中提取蘆根多糖，參考李粉玲等［9］的方法，以纖維素酶分解蘆根，并通過醇提、濃縮和純化后制得高濃度蘆根多糖液，分光光度法測(cè)得原液濃度為36.8 mg／mL。夏枯草多糖的提取參照文獻(xiàn)方法［10］，分光光度法測(cè)得原液濃度為 18.0 mg／mL。

1.5 數(shù)據(jù)處理及藥物評(píng)價(jià) 用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先計(jì)算提取物不同濃度下的平均OD值（以±S.E表示），依此根據(jù)公式計(jì)算對(duì)細(xì)胞的抑制率或保護(hù)率，最后以藥液對(duì)細(xì)胞保護(hù)率來評(píng)價(jià)中藥提取物的效果，細(xì)胞保護(hù)率越大則說明藥物抗PRRSV作用越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 中藥提取物對(duì)Marc-145細(xì)胞的安全濃度細(xì)胞病變效應(yīng)作用（CPE）觀察結(jié)果表明，三種中藥提取物對(duì)Marc-145細(xì)胞都有一定的毒性作用，主要表現(xiàn)為細(xì)胞折光性增加、粘連、變圓、破碎、脫落。藥液濃度越高，對(duì)細(xì)胞毒性越大，存活細(xì)胞越少，其MTT法檢測(cè)的OD值也越小，符合中藥濃度過高導(dǎo)致毒副作用的規(guī)律。結(jié)合CPE觀察結(jié)果，根據(jù)公式計(jì)算不同濃度蘆根多糖對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，當(dāng)生長(zhǎng)抑制率為0則表明該濃度下提取物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，從而確定藥物最大安全濃度（表1）。結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯鹽對(duì)細(xì)胞的最大安全濃度為0.156 mg／mL，蘆根多糖為 0.575 mg／mL，夏枯草多糖為 1.125 mg／mL。

表1 中藥提取物對(duì)Marc-145細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率及安全濃度

2.2 中藥提取物抗PRRSV的藥效 穿心蓮內(nèi)酯鹽對(duì)PRRSV感染時(shí)在阻斷作用方式中，濃度高于0.08 mg／mL時(shí)，反而沒有阻斷作用，隨著濃度的降低，保護(hù)率越來越強(qiáng)；抑制作用方式中，從0.04～0.16 mg／mL下，抑制作用強(qiáng)，保護(hù)率均為100%。濃度低于0.02 mg／mL則抑制作用明顯下降；而殺滅作用方式中，從0.02～0.16 mg／mL下，都有殺滅作用，保護(hù)率均為100%。

蘆根多糖抗PRRSV感染的試驗(yàn)顯示，在最高濃度0.575mg／mL時(shí)能阻斷PRRSV吸附，100%保護(hù)細(xì)胞，濃度下降保護(hù)率隨之下降。在0.575～0.144 mg／mL濃度下顯著抑制PRRSV的增殖。直接殺滅作用很強(qiáng)，在最小實(shí)驗(yàn)濃度0.072 mg／mL下對(duì)細(xì)胞保護(hù)率仍達(dá)100%?？傮w來說，蘆根多糖對(duì)PRRSV的直接殺滅作用大大強(qiáng)于阻斷作用。

夏枯草多糖對(duì)PRRSV的阻斷作用不強(qiáng)但可顯著抑制PRRSV的增殖，在合適濃度下對(duì)PRRSV也有殺滅作用。和穿心蓮內(nèi)酯鹽一樣其阻斷作用在高濃度下不起作用，濃度降至0.141 mg／mL時(shí)開始具有一定作用。而所檢測(cè)的四個(gè)濃度范圍都可有效抑制PRRSV的增殖，保護(hù)率達(dá)100%。殺滅效果中兩個(gè)高濃度組都可達(dá)到100%保護(hù)效果，隨著濃度下降保護(hù)作用降低。

表2 不同濃度的中藥提取物體外抗PRRSV作用的細(xì)胞保護(hù)率 %

3 討論

3.1 中藥提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的安全濃度 穿心蓮內(nèi)酯鹽、蘆根多糖和夏枯草多糖對(duì)Marc-145細(xì)胞安全濃度分別為0.156、0.575和1.125 mg／mL，對(duì)比冼瓊珍對(duì)中藥整體試驗(yàn)得到的安全濃度為6.25、12.5 和 1.56 mg／mL 可以看出［4］，穿心蓮內(nèi)酯鹽和蘆根多糖對(duì)細(xì)胞的安全濃度顯著下降達(dá)20倍以上，說明這兩種中藥提取物成分可能分別是這兩種中藥的主要引起細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的物質(zhì)，對(duì)安全使用這兩種中藥起到主要限制作用。而夏枯草多糖和夏枯草整體對(duì)細(xì)胞的安全濃度差別不大［4］，說明這種中藥的多糖成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制很小，可以安全使用。

3.2 中藥提取物抗病毒作用 與冼瓊珍用中藥整體試驗(yàn)結(jié)果比較［4］，中藥提取物對(duì)PRRSV的阻斷作用和抑制作用上兩者非常相似，三種中藥及其提取物對(duì)病毒的增殖都有明顯的抑制作用，可以保護(hù)感染了病毒的細(xì)胞，使其正常生長(zhǎng)；而在阻斷病毒粘附上除了蘆根和蘆根多糖在最高安全濃度組有作用外，其他都沒有明顯效果。說明在抑制作用和阻斷作用兩種抗病毒方式上，三種提取物分別是這三種中藥抗病毒的組成成分。在病毒的殺滅作用上，三種中藥提取物明顯比中藥整體藥效增強(qiáng)，說明這些提取物為殺滅病毒的藥效成分，并且在無(wú)其他中藥成分干擾情況下直接殺滅病毒的作用增強(qiáng)。

從三種中藥提取物抗病毒的作用方式來看，對(duì)病毒的抑制和殺滅作用要大于阻斷作用，這提示在使用這些中藥提取物時(shí)的劑型和吸收方式應(yīng)該適應(yīng)于藥物的作用方式。試驗(yàn)結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯鹽、蘆根多糖和夏枯草多糖均有抗病毒作用，尤其是具有一定的殺滅病毒的作用，說明這三種成分為抗病毒中藥的主要藥效成分。

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