張崇威，班付國，宋志超，陳 薔，吳寧鵬

（河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008）

隨著畜牧業(yè)發(fā)展，用于預防和治療禽畜疾病的獸藥品種也不斷增加，人藥獸用以及獸用藥物殘留超標的現象也越來越多［1］。阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素、頭孢匹林、頭孢拉定屬于人用藥物，尚未批準在獸醫(yī)臨床上使用，但在實際的畜產品藥物殘留檢驗中卻時有發(fā)現。頭孢氨芐、頭孢噻肟作為常用獸藥在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中被濫用導致殘留量超標現象嚴重。造成這種現象的原因，主要是由于一些不法養(yǎng)殖者在養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用，從而造成在禽畜產品中的殘留超標。為打擊和防范違法使用和濫用這些藥物，有必要建立這7種藥物殘留的同步檢測技術。目前，對于此7種藥物的單個或多個檢測方法也分別有報道，已報道的有13種林可胺類及大環(huán)內酯類藥物的檢測［2］，以及13種β-內酰胺類藥物殘留檢測［3］，但是同時測定該7種藥物殘留的檢測方法尚未見報道。本研究建立了7種藥物殘留的快速、準確、同步檢測的液相色譜-串聯質譜方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 Acquit UPLC-Xevo TQ-S質譜聯用儀（Waters公司）；3K-30臺式高速冷凍離心機（Sigma公司）；R215 Professional旋轉蒸發(fā)儀（瑞士 Buchi公司）；IKAMS3.Basic圓周振蕩器（廣州儀科實驗室技術有限公司）；ALC-2100.2電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）。

1.2 試劑 甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，實驗用水為一級水；阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素、頭孢氨芐標準品來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，頭孢匹林、頭孢噻肟、頭孢拉定標準品來源于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 標準貯備液的配制 分別精密稱取7種標準品各約10 mg，置于10 mL量瓶中，阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素標準品用乙腈溶解并稀釋成約1 mg／mL的標準貯備液；頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢噻肟、頭孢拉定用50%乙腈溶液溶解，并稀釋成濃度約1 mg／mL的標準貯備液。然后用50%乙腈溶液逐步稀釋成適當濃度的混合標準工作液。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫 30 ℃；流動相 A：乙腈，B：0.1%甲酸溶液；進樣量 5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應監(jiān)測 MRM；離子源溫度150℃；霧化溫度500 ℃；霧化器流速1000 L／h；錐孔氣流速150 L／h；毛細管電壓2.9 kV；定性、定量離子對及對應的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 7種藥物定性、定量離子及對應的錐孔電壓和碰撞能量

1.4.3 樣品前處理 稱取2±0.02 g勻質樣品，置于50 mL 離心管內，加乙腈溶液（15+2，V／V）10 mL，渦旋混勻，中速振蕩10 min，8000 r／min 離心5 min，轉移上清液于另一50 mL離心管內。重復提取一次，合并提取液。向提取液中加正己烷8 mL，渦旋混合 5 min，5000 r／min 離心 5 min，吸取下層溶液10 mL于雞心瓶中，50℃下旋轉蒸發(fā)至干，加入2.00 mL 20%乙腈溶液溶解殘渣，過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯質譜檢測。

2 結果

2.1 線性關系 精密吸取200 μg／L的標準混合中間液 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL，分別加入雞心瓶中，并向其中加入 10 mL空白基質，從“50℃下快速旋轉蒸發(fā)至干”開始，按照樣品同步處理。 從而配制成 2、5、10、20、50、100 μg／L 的系列標準溶液，并依次上機，以各藥物的質量濃度為橫坐標，定量離子的質量色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（表 3），可以看出 7種藥物在 2～100 μg／L范圍內呈現出良好的線性關系，相關系數均在0.998以上。

表3 7種藥物的標準曲線及相關系數

2.2 檢測限和定量限 向空白豬肉、雞肉、雞蛋試樣中添加適量的混合標準溶液，經處理上機。根據特征質量色譜峰的信噪比S／N＞3為檢測限，S／N＞10為定量限，檢測到阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素的檢測限為 0.5 μg／kg，定量限為 1 μg／kg，頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢噻肟、頭孢拉定的檢測限為2 μg／kg，定量限為 4 μg／kg。

2.3 方法的靈敏度和準確度 分別在豬肉、雞肉、雞蛋組織中添加 4、8、20 μg／kg的 7 種藥物進行回收率試驗，每個濃度做5個平行，連續(xù)測定3批，其平均回收率、變異系數如表4。阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素的回收率在80%～100%之間，頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢噻肟、頭孢拉定的回收率在70%～90%之間，批內批間的變異系數均小于20%。圖1為空白雞肉中添加8 μg／kg的各藥物特征離子質量色譜圖。

表4 7種藥物的標準曲線及相關系數

圖1 空白雞肉中添加8 μg／kg的7種藥物特征離子質量色譜圖

3 討論與小結

3.1 色譜條件的優(yōu)化 由于頭孢類藥物結構中含有較強酸性的羧基，在以硅膠為固定相中易出現拖尾和峰形異常的現象，因此選用高純硅膠為基體并經端基封閉的反相色譜柱作為色譜分析柱［2］。已報道的流動相有甲酸銨水溶液和乙腈［4］，考慮到流動相中有機溶劑含量、離子強度以及pH值大小，都會對阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素的離子化強度、溶解性以及在色譜柱上的分離產生影響［5］。所以，實驗選用乙腈和0.1%甲酸溶液為流動相，并進行梯度洗脫，得到了分離度以及對稱因子均較好的峰形。

3.2 質譜條件的優(yōu)化 首先采用以100 ng／mL的各種藥物的標準溶液在ESI+的模式下進行母離子掃描，確定準確的準分子離子，然后測出相應2個子離子，并優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量等質譜參數，使其相應的響應值達到最大。

3.3 提取液的優(yōu)化 阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素屬弱堿性藥物，易溶于酸性水溶液和極性較大的有機溶劑，這類藥物的提取和凈化主要依據其弱堿性、脂溶性和酸不穩(wěn)定性進行優(yōu)化［5］，已報道提取溶劑有 Tris 緩沖液［6］、偏磷酸-甲醇溶液［7］、甲醇和乙腈等，而頭孢類藥物由于本身結構帶有羧基基團，所以在堿性環(huán)境中水溶性較好，已報道的提取液有磷酸鹽緩沖鹽（pH 8.5）［8］、0.5%的冰醋酸水溶液［4，9］，乙腈等，本實驗綜合考慮了阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素以及頭孢類藥物的溶解性之間的差異和相近之處，并考察乙腈 ∶水＝95∶5（V／V）、乙腈 ∶水＝90 ∶10（V／V）、乙腈 ∶水＝80 ∶20（V／V）、乙腈 ∶水＝15∶2（V／V）作為提取液，發(fā)現提取液為乙腈 ∶水＝90∶10（V／V）或者乙腈比例增加時，頭孢類的提取效率非常低，而當提取液為乙腈∶水＝80∶20（V／V）或者水比例再提高時，阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素的提取率就比較低，最終確定乙腈 ∶水＝15∶2（V／V）溶液作為提取液。

3.4 凈化條件的優(yōu)化 阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素的凈化方法常用液液萃取、固相萃取等方法，已報道的固相萃取柱有 C18、HLB、SCX 柱等［2］。頭孢類藥物的凈化方法有固相萃取，已報道的固相萃取柱有 Oasis HLB［8］、XAD-2 固相萃取等［9］。 可見，7種藥物提取液的凈化柱可以采用HLB柱，但經HLB柱凈化后頭孢類藥物的回收率較低，且過柱時容易堵塞，本實驗考慮到樣品基質特性，采用液液萃取的方法用正己烷除去脂肪等極性較小的雜質，省去固相萃取的步驟，使得前處理簡潔經濟，同時也得到了滿意的實驗結果。

本研究通過摸索，得出乙腈與水適宜比例的溶液用于同時提取7種藥物，同時優(yōu)化液相色譜條件和質譜條件，從而建立了豬肉、雞肉、雞蛋中7種藥物同時檢測的UPLC-MS／MS方法，并且其靈敏度和準確度滿足藥物殘留的分析。

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