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      四君子湯對脾虛大鼠腸黏膜TFF3蛋白表達及TFF3mRNA表達的影響

      2014-11-24 02:55:44竇逾常王垂杰
      中國實驗診斷學(xué) 2014年5期
      關(guān)鍵詞:四君子湯條帶脾虛

      張 博,竇逾常,王垂杰

      (1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧 沈陽110032;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033;

      3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽110033)

      祖國醫(yī)學(xué)認為,脾主運化,為后天之本,氣血生化之源。脾為人體正常生命活動提供必需的營養(yǎng)物質(zhì),維持人體的內(nèi)外平衡。脾虛是全身性的綜合病理狀態(tài),與消化系統(tǒng)疾病發(fā)生的關(guān)系最為密切,主要表現(xiàn)為消化系統(tǒng)功能的減退和紊亂等。脾虛狀態(tài)下,腸道黏膜屏障功能紊亂,出現(xiàn)病理性損傷[1]。三葉因子(TFFs,Trefoilfactors)是一族富含半胱氨酸的小分子多肽。其中小腸三葉因子(TFF3或ITF)具有很強的細胞保護作用,能促進胃腸黏膜細胞增殖,還能同胃腸黏液中的糖蛋白結(jié)合、穩(wěn)定黏液屏障,因而在減輕腸道損害,促進腸道修復(fù)方面占據(jù)重要地位[2]。四君子湯是臨床上用于脾虛證治療的代表方劑,本研究通過觀察脾虛大鼠腸黏膜TFF3蛋白表達及TFF3mRNA表達的變化,及四君子湯對其影響,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

      1 材料與方法

      1.1 動物分組

      SPF級SD大鼠20只,體重250g左右。雌雄各半,分籠,標準飼料喂養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法分成4組,即正常對照組、脾虛模型組、自然復(fù)健組和四君子湯組。除正常對照組外,其余3組均制作大鼠長期脾虛模型。① 正常對照組大鼠常規(guī)喂養(yǎng),生理鹽水4ml/(次·只)灌胃,隔日1次,共7周。②脾虛模型組大鼠小承氣湯(1.5ml/100g)灌胃,當日禁食不禁水,隔日1次,同時隔日足量喂食且游泳至耐力極限1次(以口鼻首次沒入水中為準),共7周。③自然復(fù)健組喂養(yǎng)方法前4周同脾虛模型組,4周后改為常規(guī)飼養(yǎng),共7周。④四君子湯組喂養(yǎng)方法前4周同脾虛模型組;4周后改為常規(guī)飼養(yǎng),同時用四君子湯灌胃3周,(1.5ml/100g),每日1次。于實驗7周末處死大鼠后取材處理。于實驗7周末處死大鼠,取出3cm回腸黏膜組織,用0.9% 生理鹽水沖洗干凈,冰上刮取腸黏膜,放至內(nèi)-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2 主要儀器與試劑

      電子天平,JY5002型,0.01g-500g,上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。電子天平,BS223S型,0.001g-220g,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有統(tǒng)公司生產(chǎn)。電熱恒溫培養(yǎng)箱,HH·B11·500型,上海躍進醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。微量移液器,美國熱電公司生產(chǎn)。PCR儀,BIO-RAD型,美國BIO公司生產(chǎn)。電泳儀,北京六一儀器設(shè)備廠生產(chǎn)。

      總RNA 提取試 劑、RT-PCR 試 劑 盒、DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物由北京三博遠志生物科技有限公司代為合成。親和純化兔抗大鼠多克隆抗體購自美國santa公司,羊抗兔二抗、蛋白marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。小承氣湯由厚樸、枳實、大黃(比例3∶3∶2)組成;四君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草(比例2∶2∶2∶1)組成,均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供,并由該院制劑室制成100%煎劑。

      1.3 測定方法

      1.3.1 腸黏膜TFF3蛋白表達的測定

      蛋白印跡(Western-Blot)法測定回腸組織中TFF3蛋白表達的變化:按組織凈重與裂解液1∶10的比例加入蛋白提取試劑,并用玻璃勻漿器在冰上進行勻漿,勻漿后靜置于冰上20min,10 000轉(zhuǎn)/分進行離心,離心15min,分離上清液即為總蛋白備用。采用考馬斯亮藍法對各組總蛋白進行蛋白定量,每孔上樣20μg總蛋白進行電泳,半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,一抗(1∶200)4℃孵育過夜、二抗(1∶2 000)室溫孵育1h,ECL發(fā)光,膠片曝光,掃描膠片,分別測定目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶灰度值,以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值比值作為統(tǒng)計量,分析蛋白表達情況。

      1.3.2 TFF3mRNA表達的測定

      采用RT-PCR方法對各組大鼠回腸黏膜組織TFF3mRNA表達水平進行檢測:TFF3上游引物5-AGCCCAGGAATTTGTTGGCC-3,下游引物5-TCAAAATGTACATTCTGTCT-3,擴增片段長度184bp。以GAPDH做為內(nèi)參,(基因號:X02231),GAPDH 游 引 物 為 5′GCTGGTGCTGAGTATGTCGT,下游引物5′GAATGGGAGTTGCTGTTGAA,擴增片段長度608bp。凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像,并測定目的基因條帶和內(nèi)參基因條帶的積分光密度值,以目的條帶積分光密度值/內(nèi)參基因積分光密度值的比值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù),進行TFF3mRNA表達水平分析。

      1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

      應(yīng)用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。所測得數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標準差”(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 與空白對照組相比,脾虛各組腸組織中TFF3蛋白的表達均有下降,其中四君子湯組TFF3蛋白的表達高于自然復(fù)健組及脾虛模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)。見表1。

      表1 各組大鼠回腸組織中TFF3蛋白的表達

      2.2 與空白對照組相比,脾虛各組腸組織中TFF3 mRNA的表達均下降,其中四君子湯組TFF3mRNA的表達優(yōu)于自然復(fù)健組及長期脾虛模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)。見表2,圖1。

      表2 各組大鼠回腸組織中TFF3mRNA的表達

      圖1 各組大鼠回腸組織中TFF3mRNA的表達

      3 討論

      腸三葉因子(TFF3或ITF intestinal trefoil factor)是三葉肽家族成員之一,由腸黏膜上皮杯狀細胞分泌,廣泛存在于胃腸道,與MUC2等在腸黏膜中相互鏈接,在黏膜中構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),抵抗胃腸道酸流,蛋白酶降解和機械損傷,從而保護腸黏膜免受損害[3]。同時,TFF3可以驅(qū)動受損黏膜周圍完好的上皮細胞向黏膜損傷表面遷移覆蓋,加速損傷修復(fù),且TFF3較EGF引起的細胞遷徙,能減少細胞間隙的產(chǎn)生,更能精密修復(fù)黏膜損傷部位[4],保持腸黏膜完整。TFF3能促進NF-κB的活性,從而增強ICE-18細胞的抗凋亡能力;而PI3-K/Akt途徑促進了TFF3和MUC2在小腸上皮細胞的表達,TFF3又能反過激活PI3-K/Akt途徑,以此來下調(diào)Caspase-3/9的活性[5]。研究表明,TFF3在抑制腸道黏膜凋亡、杯狀細胞的分化中也起著重要作用,從而對黏膜起到保護作用。另外,有研究發(fā)現(xiàn),TFF3可能通過促進環(huán)氧化酶-2合成,繼而促進前列腺素-2生成,從而避免氧化應(yīng)激對上皮細胞的損傷,來發(fā)揮細胞保護作用[6]。借助Scr和激活STAT3誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子表達,有助于細胞的重建[7]。TFF3被認為是內(nèi)源性具有抗凋亡特性的肽類物質(zhì),在腸道的自我保護和損傷后修復(fù)中占有重要地位。

      脾虛證大鼠出現(xiàn)胃腸黏膜上皮局灶壞死脫落,炎性滲出,胃腺、腸腺萎縮,腸黏膜上皮壞死脫落。上皮細胞內(nèi)含有大量自噬泡,腺體萎縮。黏膜下層水腫,細胞排列疏松。腸黏膜微絨毛排列稀疏紊亂,長短不一[8]。黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量均顯著增加,絨毛頂端與黏膜下層TLR2表達量均顯著降低[9]。證明脾虛大鼠腸黏膜存在病理器質(zhì)性損傷,進而可能引起腸黏膜功能損害。

      本文觀察到與空白對照組相比,脾虛各組大鼠腸黏膜TFF3蛋白表達及TFF3mRNA表達顯著下調(diào),這提示脾虛狀態(tài)下大鼠腸黏膜病理器質(zhì)性損傷,防御能力減弱。四君子湯組經(jīng)治療后TFF3蛋白表達及TFF3mRNA表達明顯增加,優(yōu)于自然復(fù)健組及長期脾虛模型組,提示四君子湯可增強TFF3mRNA與蛋白的表達,這一結(jié)果也表明四君子湯能夠促進受損腸黏膜細胞的修復(fù),增強腸黏膜防御能力。從而對腸黏膜屏障發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

      [1]曾 星,賀 毅,周 丹,等.甘草對脾虛證消化道黏膜及細胞保護的分子藥理機制研究進展[J].時珍國醫(yī)藥,2010,21(8):2030.

      [2]Xue L,Aihara E,Podolsky D K,et al.In vivo action of trefoil factor 2(TFF2)to speed gastric repair is independent of cyclooxy-genase[J].Gut,2010,59(9):1184.

      [3]R J Longman,J Douthwaite.Coordinated localisation of mucins and trefoil peptides in the ulcer associated cell lineage and the gastrointestinal mucosa[J].Gut,2000,792.

      [4]Dürer U,Hartig R,Bang S,et al.TFF3and EGF induce different migration patterns of intestinal epithelial cells in vitro and trigger increased internalization of E-cadherin[J].Cell PhysiolBiochem ,2007,20:329.

      [5]Durual S,Blanchard C,Perrot V,et al.Expression of human TFF3in relation to growth of HT-29cell subpopulations:involvement of PI3-K but not STAT6[J].Differentiation,2005,73:36.

      [6]Tan XD,Chen YH,Liu QP,et al.Prostanoids mediate the protective effect of trefoil factor 3in oxidant-induced intestinal epithelial cell injury:role of cyclooxygenase-2[J].J Cell Sci,2000,113(Pt 12):2149.

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      [8]姚永莉,宋于剛,趙 彤,等.大鼠脾虛證模型的胃腸黏膜形態(tài)學(xué)研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合脾胃雜志,2000,8(1):8.

      [9]尹 朋,趙 燁,朱曉宇,等.實驗性脾虛大鼠小腸結(jié)構(gòu)與免疫功能的變化[J].中國獸醫(yī)雜志,2010,46(1):16.

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