乳鼠成纖維細(xì)胞在人血清中的存活與增殖的研究

肖揚(yáng)+李裕舒+董平栓

【摘要】 目的：本研究旨在證明人血清直接培養(yǎng)乳鼠成纖維細(xì)胞是可行的。方法：將乳鼠成纖維細(xì)胞分別在胎牛血清及人血清中培養(yǎng)，通過(guò)在顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞形態(tài)及密度，同時(shí)用MTT比色法檢測(cè)吸光度來(lái)對(duì)比成纖維細(xì)胞在胎牛血清及人血清中的增殖活性。結(jié)果：兩種實(shí)驗(yàn)方法均顯示：兩組成纖維細(xì)胞在第一天的增殖活性無(wú)顯著性差異，第四天人血清組的成纖維細(xì)胞增殖明顯比胎牛血清組活躍。結(jié)論：乳鼠成纖維細(xì)胞在人血清中不僅可以存活，而且有增殖行為。

【關(guān)鍵詞】 成纖維細(xì)胞； 人血清

Observation on Surviving and Proliferation of Neonatal Rat Fibroblasts in Human Serum/XIAO Yang， LI Yu-shu，DONG Ping-shuan.//Medical Innovation of China，2014，11（31）：015-017

【Abstract】 Objective： To prove that human serum directly is feasible to culture rat fibroblasts. Method： Rat fibroblasts were cultured in serum and fetal bovine serum， by observing the morphology and density of fibers under a microscope， and with the MTT ratio test to compare the absorbance of cells into proliferative activity in serum and fetal bovine serum. Result： There was no significant difference between two groups in the first day； but the fibroblasts proliferation rate in human serum was higher than in fetal bovine serum. Conclusion： Neonatal rat fibroblasts in human serum can survive and proliferate in human serum.

【Key words】 Fibroblast； Albumin Human

First-authors address： The First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.31.005

成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織中常見(jiàn)的細(xì)胞，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)，細(xì)胞扁平，多突起，呈梭形、三角形、不規(guī)則形，它參與人體的纖維化過(guò)程。過(guò)度纖維化會(huì)導(dǎo)致器官形態(tài)及功能的異常，心臟的纖維化可導(dǎo)致心臟擴(kuò)大、心衰、心律失常等[1]，因此心臟纖維化是目前心臟研究的熱點(diǎn)。研究過(guò)程中常會(huì)用到成纖維細(xì)胞，但限于成纖維細(xì)胞的取材限制，常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)胞，多用動(dòng)物血清培養(yǎng)[2]，但用人血清直接培養(yǎng)的卻很少。本研究旨在證明人血清直接培養(yǎng)乳鼠心臟成纖維細(xì)胞的可行性，為成纖維細(xì)胞在人體中的增殖研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 乳鼠（SD大鼠）；胰酶1：250（Amresco公司生產(chǎn)）；膠原酶B型（Roche公司生產(chǎn)）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibico公司生產(chǎn)）；噻唑藍(lán)MTT（Sigma公司生產(chǎn)）；二甲基亞砜DMSO（Amresco公司生產(chǎn)）；倒置顯微鏡（Olympus公司生產(chǎn)，型號(hào)IX74 TH4-200）；酶標(biāo)儀（BIO-TEK公司生產(chǎn)，型號(hào)ELX 800）。實(shí)驗(yàn)分組：選擇胎牛血清組為對(duì)照組；選擇正常人15例為實(shí)驗(yàn)組，年齡（57.0±1.3）歲。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料處理方法

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)血清處理方法及原代培養(yǎng)液制備 將無(wú)菌促凝管中抽取的成人動(dòng)脈血，置于4 ℃溫度下1 h，待血液凝固后，離心（3000轉(zhuǎn)/min）10 min，取上清置于離心管中，實(shí)驗(yàn)用的胎牛血清從試劑公司購(gòu)回，在無(wú)菌超凈臺(tái)中將其分裝至無(wú)菌小瓶中看，置于-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。每次使用時(shí)將其置于室溫下完全溶解即可使用。將處理好的人或胎牛血清加入達(dá)爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養(yǎng)基，血清濃度為10%，有研究顯示血清濃度為10%～15%時(shí)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)良好[3]，放置于無(wú)菌超凈臺(tái)中用濾膜微孔為0.22微米的一次性濾器濾過(guò)除菌，制備成原代培養(yǎng)液，按照100 U/mL的濃度加入雙抗（分別將青霉素和鏈霉素用無(wú)菌蒸餾水完全溶解后制成的溶液）以抑制培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌的生長(zhǎng)，防止細(xì)胞被污染，置于-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 乳鼠心臟成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)步驟 在超凈臺(tái)中，取乳鼠（出生3 d以?xún)?nèi)）心臟，剪碎后用雙酶消化（2.5 g/L胰酶+1 g/L膠原酶），第一次消化10 min后棄上清，從第二次開(kāi)始每次消化5 min，將上清轉(zhuǎn)移到含有原代培養(yǎng)液的無(wú)菌離心管中，直至將組織消化完畢，離心（1000轉(zhuǎn)/min）10 min，棄上清，加入培養(yǎng)基混勻，分裝在50 mL培養(yǎng)瓶中，置于溫度為37 ℃，CO2濃度為50 mL/L的培養(yǎng)箱中，兩小時(shí)后棄去上清，將分離出的成纖維細(xì)胞分為二等分，分別用含有胎牛血清和人血清的原代培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液。每個(gè)樣本換液均用其原代培養(yǎng)液。體外成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)容器的典型存活和生長(zhǎng)方式是貼壁和增殖，貼壁成纖維細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下觀察為梭形、三角形或不規(guī)則形，有較長(zhǎng)的偽足樣突起。endprint

1.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得方法

1.2.2.1 顯微鏡下觀察步驟：將培養(yǎng)容器放置在倒置顯微鏡（Olympus公司生產(chǎn)，型號(hào)IX74TH4-200）下選擇細(xì)胞輪廓清晰的視野進(jìn)行照相記錄。

1.2.2.2 檢測(cè)成纖維細(xì)胞增殖的MTT（噻唑藍(lán)）比色法步驟：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用2.5 g/L的胰酶消化，在顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞變圓，棄去胰酶，加入原代培養(yǎng)液吹打，吹打完畢后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每孔約4000個(gè)細(xì)胞，200 μL培養(yǎng)液。連續(xù)6 d檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)當(dāng)天，每孔加入5 ?L MTT，放入溫度為37 ℃，CO2濃度為50 mL/L的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加入150 ?L的二甲基亞砜，10 min搖勻后，以570 nm為測(cè)量波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)每孔的光吸收值（OD），以不加細(xì)胞的空白孔OD值作調(diào)零值，并以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組計(jì)量資料用（x±s）表示，數(shù)據(jù)分析用配對(duì)t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)處理使用軟件SPSS 13.0完成，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡（×200）下，成纖維細(xì)胞形態(tài)結(jié)果 傳代后，在倒置顯微鏡（×200）下觀察成纖維細(xì)胞形態(tài)及密度，A、C為FCS所培養(yǎng)，B、D為HFS所培養(yǎng)。第1天兩種含不同血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，呈梭形或三角形，有較長(zhǎng)偽足樣突起，且密度大致相同，如圖1中A、B所示。第4天兩種含不同血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞相似，呈梭形、三角形或不規(guī)則形，但密度不同：含F(xiàn)CS培養(yǎng)基培養(yǎng)出的成纖維細(xì)胞密度大于含HFS培養(yǎng)基的，見(jiàn)圖1中C、D。與第1天相比，每種培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的密度均比同種在第1天觀察到的密度大。

2.2 吸光度與時(shí)間關(guān)系 根據(jù)每日檢測(cè)結(jié)果繪制細(xì)胞增殖的吸光度與時(shí)間關(guān)系曲線。（圖表中數(shù)據(jù)為細(xì)胞增殖的吸光度值，為各組各樣本每天吸光度值的均數(shù)。從圖中可以看出，兩組細(xì)胞吸光度均隨培養(yǎng)天數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)，其中牛血清組的上升趨勢(shì)快于人血清組，見(jiàn)圖2。

圖1 第二代成纖維細(xì)胞倒置顯微鏡下形態(tài)

圖2 細(xì)胞增殖的吸光度與時(shí)間關(guān)系曲線圖

2.3 兩組吸光度的比較結(jié)果 兩組吸光度在第1天比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第4天兩組吸光度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且牛血清組吸光度高于人血清組，見(jiàn)表1。

表1 三組MTT檢測(cè)細(xì)胞吸光度值（x±s）

組別 第1天 第4天

FCS組 0.012±0.010 0.182±0.013△

HFS組 0.008±0.002 0.156±0.033*

*與FCS組相比較，P<0.05；△與HFS組相比較，P<0.05

3 討論

成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織中常見(jiàn)的細(xì)胞，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)。電鏡下可看到胞質(zhì)中有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離的多核糖體和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體，表明該細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的活動(dòng)旺盛，在正常情況下，這種細(xì)胞多處于靜止?fàn)顟B(tài)，功能活動(dòng)不活躍，成為纖維細(xì)胞，而在創(chuàng)傷等條件下可被炎癥介質(zhì)趨化，進(jìn)入增殖活化狀態(tài)，成纖維細(xì)胞可以合成和分泌彈性纖維、網(wǎng)狀纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分[4]，同時(shí)還可合成和分泌金屬蛋白酶及其抑制劑，間接參與舊膠原的降解和新膠原的重排、沉積，參與受損組織的纖維性修復(fù)即纖維化過(guò)程，然而，過(guò)度的纖維化使器官及組織喪失原有的形態(tài)或功能[5-6]。因此，纖維化的發(fā)生發(fā)展成為研究的熱點(diǎn)，成纖維細(xì)胞成為該類(lèi)研究不可或缺的研究部分，心臟纖維化是目前心臟疾病研究的熱點(diǎn)，心臟的纖維化不僅能造成心臟結(jié)構(gòu)、功能的異常，導(dǎo)致心臟擴(kuò)大進(jìn)而出現(xiàn)心力衰竭[7]，也由于心臟成纖維細(xì)胞的電生理學(xué)特性造成心律失常[8]，由于在人類(lèi)活體上獲取心臟組織細(xì)胞有一定難度，而且可能會(huì)對(duì)受試者造成不可知的傷害，因此本研究選取出生3 d以?xún)?nèi)的乳鼠心臟作為成纖維細(xì)胞的來(lái)源器官，利用在同一培養(yǎng)皿中心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同分離出心臟成纖維細(xì)胞[9]。目前的科學(xué)研究中，多用動(dòng)物血清來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，其培養(yǎng)的細(xì)胞存活率較高、分裂增殖活動(dòng)比較活躍[10]，而關(guān)于成年動(dòng)物血清尤其是人類(lèi)血清培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞是否出現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象的研究甚少，而選擇人類(lèi)血清直接培養(yǎng)細(xì)胞要比動(dòng)物血清培養(yǎng)細(xì)胞之后再進(jìn)行相關(guān)的干預(yù)更具說(shuō)服力。

在倒置顯微鏡下，成活的乳鼠心臟成纖維細(xì)胞呈梭形、三角形或不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)透明、向外伸出突起呈偽足樣，細(xì)胞核大，呈橢圓形，無(wú)自發(fā)性搏動(dòng)，顯微鏡下可直接看到成活乳鼠成纖維細(xì)胞的形態(tài)及密度。MTT比色法是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm或570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。

本研究將人血清和胎牛血清培養(yǎng)乳鼠心臟成纖維細(xì)胞的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，第1天鏡下觀察到的含兩種不同血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞密度無(wú)明顯差異（見(jiàn)圖1的A、B）且MTT結(jié)果中吸光度無(wú)顯著差異（見(jiàn)表1），說(shuō)明第1天時(shí)成纖維細(xì)胞處在一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，到第4天時(shí)每種培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的密度均比同種在第1天觀察到的密度大（見(jiàn)圖1的C、D），且在培養(yǎng)的頭4天，MTT結(jié)果顯示吸光度都隨時(shí)間呈增長(zhǎng)趨勢(shì)（見(jiàn)圖2），這說(shuō)明兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞均已存活，且有數(shù)量上的增加，即有分裂增殖行為。在第二代細(xì)胞培養(yǎng)第4天以后，兩種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞經(jīng)MTT法檢測(cè)的吸光度都有下降的趨勢(shì)，提示成纖維細(xì)胞的數(shù)量有所下降，這可能跟培養(yǎng)的空間有限，限制了細(xì)胞的增殖。綜合以上鏡下觀察以及MTT吸光度的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，乳鼠心臟成纖維細(xì)胞在胎牛血清培養(yǎng)基中可存活并分裂增殖，在人血清培養(yǎng)基中顯示了同樣的趨勢(shì)。對(duì)比兩組結(jié)果，成纖維細(xì)胞在胎牛血清中生長(zhǎng)更為活躍，可能與胎牛血清中含有更多的刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明，乳鼠心臟成纖維細(xì)胞不僅可在人血清中存活，且有增殖行為，乳鼠成纖維細(xì)胞直接由人血清培養(yǎng)是可行的。雖然該實(shí)驗(yàn)選取心臟成纖維細(xì)胞作為研究對(duì)象，但因成纖維細(xì)胞在動(dòng)物各個(gè)器官?gòu)V泛存在，且生物學(xué)特性類(lèi)似，故人血清直接培養(yǎng)其他器官來(lái)源的成纖維細(xì)胞亦是可行的，該研究為人類(lèi)血清培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的可行性提供了依據(jù)。endprint

參考文獻(xiàn)

[1]馬金，丁春華.心臟成纖維細(xì)胞與心肌纖維化[J].中華心血管病雜志，2014，42（3）：269-272

[2]劉愛(ài)旗，夏璐.CCK-8法與MTT法檢測(cè)兔成纖維細(xì)胞活性的比較研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（2）：12-13.

[3]劉鵬，金巖，劉源，等.不同種屬真皮成纖維細(xì)胞在不同血清濃度培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的比較觀察[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004，20（1）：16-19.

[4] Wynn T A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J]. J Pathol，2008，214（2）：199-210.

[5] Brown J J， Bayat A. Genetic susceptibility to susceptibility to raised dermal scarring[J]. Br J Dermatol，2009，161（1）：8-18.

[6] Juckett G， Hartman-Adams H. Management of keloids and hypertrophic scars[J]. Am Fam Physician，2009，80（3）：253-260.

[7] Li Y Q， Li X B， Guo S J， et al. Apocynin attenuates oxidative stress and cardiac fibrosis in angiotensin Ⅱ-induced cardiac diastolic dysfunction in mice[J]. Acta Pharmacol Sin，2013，34（3）：352-359.

[8]邢曉倩，徐健，蘇浩，等.犬心房顫動(dòng)模型縫隙連接蛋白40、45與心肌纖維化的相關(guān)性[J].中華心血管病雜志，2011，39（2）：176-180.

[9] Golden H B， Gollapudi D， Gerilechaogetu F， et al. Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups[J]. Methods Mol Biol，2012，843（1）：205-214.

[10]吳剛，何輝，曹月誠(chéng)，等.不同血清培養(yǎng)條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（49）：9151-9154.

（收稿日期：2014-03-24） （本文編輯：王宇）endprint

參考文獻(xiàn)

[1]馬金，丁春華.心臟成纖維細(xì)胞與心肌纖維化[J].中華心血管病雜志，2014，42（3）：269-272

[2]劉愛(ài)旗，夏璐.CCK-8法與MTT法檢測(cè)兔成纖維細(xì)胞活性的比較研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（2）：12-13.

[3]劉鵬，金巖，劉源，等.不同種屬真皮成纖維細(xì)胞在不同血清濃度培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的比較觀察[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004，20（1）：16-19.

[4] Wynn T A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J]. J Pathol，2008，214（2）：199-210.

[5] Brown J J， Bayat A. Genetic susceptibility to susceptibility to raised dermal scarring[J]. Br J Dermatol，2009，161（1）：8-18.

[6] Juckett G， Hartman-Adams H. Management of keloids and hypertrophic scars[J]. Am Fam Physician，2009，80（3）：253-260.

[7] Li Y Q， Li X B， Guo S J， et al. Apocynin attenuates oxidative stress and cardiac fibrosis in angiotensin Ⅱ-induced cardiac diastolic dysfunction in mice[J]. Acta Pharmacol Sin，2013，34（3）：352-359.

[8]邢曉倩，徐健，蘇浩，等.犬心房顫動(dòng)模型縫隙連接蛋白40、45與心肌纖維化的相關(guān)性[J].中華心血管病雜志，2011，39（2）：176-180.

[9] Golden H B， Gollapudi D， Gerilechaogetu F， et al. Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups[J]. Methods Mol Biol，2012，843（1）：205-214.

[10]吳剛，何輝，曹月誠(chéng)，等.不同血清培養(yǎng)條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（49）：9151-9154.

（收稿日期：2014-03-24） （本文編輯：王宇）endprint

參考文獻(xiàn)

[1]馬金，丁春華.心臟成纖維細(xì)胞與心肌纖維化[J].中華心血管病雜志，2014，42（3）：269-272

[2]劉愛(ài)旗，夏璐.CCK-8法與MTT法檢測(cè)兔成纖維細(xì)胞活性的比較研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（2）：12-13.

[3]劉鵬，金巖，劉源，等.不同種屬真皮成纖維細(xì)胞在不同血清濃度培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的比較觀察[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004，20（1）：16-19.

[4] Wynn T A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J]. J Pathol，2008，214（2）：199-210.

[5] Brown J J， Bayat A. Genetic susceptibility to susceptibility to raised dermal scarring[J]. Br J Dermatol，2009，161（1）：8-18.

[6] Juckett G， Hartman-Adams H. Management of keloids and hypertrophic scars[J]. Am Fam Physician，2009，80（3）：253-260.

[7] Li Y Q， Li X B， Guo S J， et al. Apocynin attenuates oxidative stress and cardiac fibrosis in angiotensin Ⅱ-induced cardiac diastolic dysfunction in mice[J]. Acta Pharmacol Sin，2013，34（3）：352-359.

[8]邢曉倩，徐健，蘇浩，等.犬心房顫動(dòng)模型縫隙連接蛋白40、45與心肌纖維化的相關(guān)性[J].中華心血管病雜志，2011，39（2）：176-180.

[9] Golden H B， Gollapudi D， Gerilechaogetu F， et al. Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups[J]. Methods Mol Biol，2012，843（1）：205-214.

[10]吳剛，何輝，曹月誠(chéng)，等.不同血清培養(yǎng)條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（49）：9151-9154.

（收稿日期：2014-03-24） （本文編輯：王宇）endprint