張 磊，張艷麗，鄭 軻，高亞會(huì)，崔元臣＊

（1.河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 開封 475004；2.中原工學(xué)院 材料與化工學(xué)院，河南 鄭州 451191；3.河南大學(xué) 特種功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004）

酶催化反應(yīng)條件較為溫和，具有綠色化學(xué)的特點(diǎn).其中酚類化合物在過氧化物酶為催化劑、H2O2為氧化劑的條件下可發(fā)生聚合反應(yīng)，該反應(yīng)提供了一種制備酚聚合物的新方法，引起了眾多學(xué)者的高度關(guān)注［1-3］.由于酚類化合物在水中的溶解度較低，DORDICK首次選擇有機(jī)溶劑與醋酸鹽緩沖溶液組成的混合體系為介質(zhì)，研究了酚化合物在辣根過氧化物酶催化下的聚合反應(yīng)［4］.KOBAYASHI課題組采用類似的體系研究了苯酚［5］和雙酚化合物的酶催化聚合［6］，而且發(fā)現(xiàn)雙酚化合物的聚合產(chǎn)物與感光劑混合后具有很好的光致抗蝕性能.CAO發(fā)現(xiàn)鄰氨基苯酚和對氨基苯酚的酶催化聚合反應(yīng)產(chǎn)率較高，且產(chǎn)物具有一定的電活性［7］.楊剛利用酶催化聚合反應(yīng)得到聚苯酚，經(jīng)進(jìn)一步化學(xué)修飾，制備了耐熱性好的含氰基聚苯酚［8］.最近，CUI還報(bào)道了含希夫堿酚化合物的酶催化聚合［9］.可以看出，如何得到具有良好應(yīng)用前景的酚聚合物逐漸成為學(xué)者們努力的方向.在此研究領(lǐng)域中，本課題組近年來實(shí)現(xiàn)了聚苯酚的酶催化可控合成，并且在聚苯酚的功能化研究方面取得了一些進(jìn)展［10-12］.

4-溴苯酚是一種重要的有機(jī)化工原料，廣泛用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、阻燃劑的合成.在酚化合物的酶催化聚合研究領(lǐng)域，尚未發(fā)現(xiàn)4-溴苯酚酶催化聚合的詳細(xì)報(bào)道.本文作者擬在有機(jī)溶劑-緩沖溶液的混合體系中系統(tǒng)研究4-溴苯酚的酶催化聚合，探討有機(jī)溶劑種類及有機(jī)溶劑和緩沖溶液配比對聚合反應(yīng)產(chǎn)率和聚合物相對分子質(zhì)量的影響.由于利用酶催化聚合制備的酚聚合物中仍保留較多的酚羥基，我們認(rèn)為這類聚合物可能具有潛在的抗氧化性能，因此本文作者進(jìn)一步研究了4-溴苯酚聚合物的抗自由基性能，并且初步評價(jià)了該聚合物的抗氧化性能.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

VERTEX70型傅立葉紅外光譜儀（德國，Bruker公司），溴化鉀壓片法；TGA/SDTA851e型熱重分析儀（瑞士，Mettler-Toledo公司），升溫速率為10℃/min；DSC822e差示掃描量熱儀（瑞士，Mettler-Toledo公司）；凝膠滲透色譜儀（Waters 515泵，柱溫為35℃，THF為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min），Wyatt DOWN Optilab rEX示差折光檢測器，Wyatt DOWN HELEOSⅡ十八角度激光光散射檢測器（美國，Wyatt公司）；723N型可見分光光度計(jì)（上海成光儀器有限公司）.

4-溴苯酚（純度99%，安耐吉化學(xué)）；辣根過氧化氫酶（HRP）（RZ＝2.6，上海國源生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為市售分析純試劑，使用前未提純.

1.2 有機(jī)溶劑-緩沖溶液混合體系中4-溴苯酚的酶催化聚合

稱取0.86g 4-溴苯酚（5mmol）加入到100mL圓底燒瓶中，加入一定體積比的有機(jī)溶劑和磷酸鹽緩沖溶液（pH＝7），總體積為60mL，將燒瓶置于25℃恒溫水浴中，開動(dòng)電磁攪拌，使4-溴苯酚溶解分散均勻.稱取1mg辣根過氧化物酶加入到燒瓶中，1min后在燒瓶中加入0.25mL 5%H2O2溶液，以后每隔5min加入等量的H2O2，共加入14次，待最后一次H2O2滴加完后繼續(xù)反應(yīng)6h，抽濾，用大量蒸餾水洗滌產(chǎn)物.產(chǎn)物在60℃真空干燥箱中干燥12h，稱重并計(jì)算產(chǎn)率.

1.3 4-溴苯酚聚合物中羥基含量的測定

取0.1g 4-溴苯酚聚合物于干燥的100mL圓底燒瓶中，準(zhǔn)確移取5.0mL 2.5%醋酸酐吡啶溶液加入到100mL圓底燒瓶中，開動(dòng)磁力攪拌.在95℃恒溫水浴中反應(yīng)1h，冷卻至室溫，加入20mL蒸餾水，充分振蕩后用0.2mol/L的NaOH溶液（準(zhǔn)確濃度記為MNaOH）滴定，以酚酞作為指示劑，待有粉紅色出現(xiàn)并保持0.5min內(nèi)不褪色時(shí)停止滴定，記錄所需NaOH溶液的體積V1（mL）.所得乙?；a(chǎn)物在60℃真空干燥箱中干燥，得到土黃色固體粉末.

空白試驗(yàn)：準(zhǔn)確移取5.0mL 2.5%醋酸酐吡啶溶液于100mL錐形瓶中，加入20mL蒸餾水，充分振蕩后用相同濃度的NaOH溶液滴定，記錄所需NaOH溶液的體積V2（mL）.聚合物中羥基含量（COH）通過式（1）計(jì)算：

1.4 4-溴苯酚聚合物的抗自由基性能檢測

用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）陽離子自由基檢測4-溴苯酚聚合物的抗自由基性能，檢測方法參照文獻(xiàn)［13-15］.

2 結(jié)果與討論

2.1 4-溴苯酚的酶催化聚合

首先研究了有機(jī)溶劑類型對4-溴苯酚酶催化聚合反應(yīng)產(chǎn)率的影響，所選擇的六種有機(jī)溶劑分別為甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、DMF和1，4-二氧六環(huán)，每個(gè)反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑和緩沖溶液的體積比固定為1∶1，反應(yīng)結(jié)果見表1.可以看出，在所選擇的有機(jī)溶劑和緩沖溶液體系中，4-溴苯酚均可發(fā)生酶催化聚合反應(yīng)，產(chǎn)率中等.另外可以看到，在所選擇的實(shí)驗(yàn)條件下，有機(jī)溶劑種類對聚合物產(chǎn)率并沒有明顯的影響.

表1 4-溴苯酚在不同有機(jī)溶劑和緩沖溶液中的酶催化聚合Table 1 Enzymatic polymerization of 4-bromophenol in the mixture of buffer and various organic solvent

以價(jià)格低、毒性小的乙醇為有機(jī)溶劑，研究了乙醇與磷酸鹽緩沖溶液（pH＝7）配比對4-溴苯酚聚合反應(yīng)的影響，結(jié)果見表2.可以明顯看出，乙醇與緩沖溶液的配比對聚合物產(chǎn)率有很大的影響，反應(yīng)體系中乙醇的用量為15～30mL時(shí)4-溴苯酚聚合反應(yīng)的產(chǎn)率較高（表2，Entries 2-5），增加或降低乙醇的用量反應(yīng)產(chǎn)率均出現(xiàn)明顯降低.TONAMI曾在甲醇和緩沖溶液混合體系中研究了間甲酚的酶催化聚合，發(fā)現(xiàn)甲醇和緩沖溶液體積比為1∶1時(shí)可得到接近100%的產(chǎn)率［16］.而對叔丁基苯酚在異丙醇和緩沖溶液混合體系中進(jìn)行的酶催化聚合，當(dāng)異丙醇的含量為30%時(shí)聚合反應(yīng)的產(chǎn)率最高［17］.結(jié)合這些研究報(bào)道，我們認(rèn)為在有機(jī)溶劑與緩沖溶液混合體系中，酚化合物種類以及有機(jī)溶劑與緩沖溶液的配比共同影響了聚合反應(yīng)的產(chǎn)率.

表2 乙醇和緩沖溶液配比對4-溴苯酚酶催化聚合反應(yīng)的影響Table 2 Effect of the volume ratio of ethanol to buffer on enzymatic polymerization of 4-bromophenol

2.2 4-溴苯酚聚合物的分子量檢測

凝膠滲透色譜和靜態(tài)光散射聯(lián)用可對聚合物的絕對重均相對分子質(zhì)量進(jìn)行測定［18］，我們采用這種方法檢測了4-溴苯酚聚合物的平均相對分子質(zhì)量.首先對4-溴苯酚聚合物四氫呋喃溶液的折光指數(shù)增量（dn/dc）進(jìn)行了測定.當(dāng)濃 度 分 別 為0.97、2.09、2.87、3.98、5.17g/L時(shí)，4-溴苯酚聚合物四氫呋喃溶液的折光指數(shù)如圖1所示，根據(jù)折光指數(shù)和聚合物濃度的線性關(guān)系，可以得到4-溴苯酚聚合物四氫呋喃溶液的dn/dc值為0.166 9，由此得到的4-溴苯酚聚合物的重均相對分子質(zhì)量列于表1和表2中.從表1可以看出，在有機(jī)溶劑和緩沖溶液等體積配比的體系中，采用甲醇和乙醇作為有機(jī)溶劑時(shí)，所得聚合物的相對分子質(zhì)量較低，而甲醇體系中所得聚合物的相對分子質(zhì)量最?。ū?，Entry 1）.這可能是由于甲醇和緩沖溶液混合體系對聚合過程中生成的酚低聚物的溶解性差，使其過早沉淀析出，無法形成高相對分子質(zhì)量聚合物造成的.采用丙酮、乙腈、1，4-二氧六環(huán)、DMF為有機(jī)溶劑時(shí)所得聚合物的相對分子質(zhì)量均在6.5×104以上.表2列出了乙醇和緩沖溶液不同配比條件下所得4-溴苯酚聚合物的平均相對分子質(zhì)量.總體上看，隨乙醇含量的增加，聚合產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量呈上升趨勢.而在對聚合反應(yīng)產(chǎn)率的研究中，我們發(fā)現(xiàn)乙醇與緩沖溶液體積比為15∶45時(shí)，4-溴苯酚（表2，Entry 2）聚合物的產(chǎn)率較高.這些研究結(jié)果表明影響聚合產(chǎn)物相對分子質(zhì)量和產(chǎn)率的因素是不同的.我們認(rèn)為，酚化合物在反應(yīng)介質(zhì)中的分散性及酶活性對反應(yīng)產(chǎn)率影響較大，而反應(yīng)介質(zhì)對酚低聚物的溶解性好壞決定了聚合產(chǎn)物相對分子質(zhì)量的高低.

圖1 示差折光指數(shù)與4-溴苯酚聚合物溶液濃度之間的線性關(guān)系Fig.1 Linearity of refractive index（RI）versus concentration of 4-bromophenol polymer solution

2.3 4-溴苯酚聚合物的結(jié)構(gòu)和性能研究

圖2中曲線a為4-溴苯酚聚合物的紅外光譜圖，3 413cm-1是O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 579和1 481 cm-1處是苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰，3 068cm-1處為苯環(huán)C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1 209cm-1處是C-O-C（或COH）的振動(dòng)吸收峰，1 112cm-1為醚鍵伸縮振動(dòng)吸收峰.因此，4-溴苯酚聚合物鏈中仍含有羥基，存在苯-苯和苯-氧兩種連接方式.為了進(jìn)一步測定聚合產(chǎn)物中羥基的含量，我們對其進(jìn)行了乙酰化處理.圖2中曲線b為4-溴苯酚聚合物乙?；a(chǎn)物的紅外光譜圖，3 413cm-1處的O-H伸縮振動(dòng)吸收峰消失，同時(shí)在1 767cm-1處出現(xiàn)C＝O的伸縮振動(dòng)吸收峰，說明聚合物的乙?；磻?yīng)比較徹底.經(jīng)滴定分析，各條件下制備的聚合物中羥基的含量在2.0～2.9mmol/g（表1和表2）.

圖3為4-溴苯酚聚合物的熱重曲線，在空氣和氮?dú)夥諊校?-溴苯酚聚合物分解5%時(shí)對應(yīng)的溫度分別為274和242℃，在空氣氛圍中聚合物完全分解時(shí)對應(yīng)的溫度為600℃，在氮?dú)夥諊?，聚合物? 000℃時(shí)的質(zhì)量殘余率為31.5%，表明該聚合物具有較好的熱穩(wěn)定性.

圖2 4-溴苯酚聚合物（a）及其乙?；a(chǎn)物（b）的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of 4-bromophenol polymer（a）and acetylated 4-bromophenol polymer（b）

圖3 4-溴苯酚聚合物在氮?dú)猓╝）和空氣（b）中的熱重曲線Fig.3 TG curves of 4-bromophenol polymer under nitrogen（a）and under air（b）

2.4 4-溴苯酚聚合物抗自由基性能研究

眾所周知，酚化合物是一類重要的抗氧劑，在塑料、橡膠、潤滑品、食品中均有廣泛的應(yīng)用.由于高相對分子質(zhì)量酚化合物具有揮發(fā)性低、耐抽提、耐高溫等優(yōu)點(diǎn)，因而近年來逐漸成為抗氧劑研究領(lǐng)域中一個(gè)重要的發(fā)展方向.4-溴苯酚聚合物中仍含有大量羥基，這可能賦予聚合物良好的抗氧化性能.對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除率常被用來評價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力［13-15］，我們利用這兩種方法初步評價(jià)了4-溴苯酚聚合物的抗氧化性能，測定樣品為等體積乙醇和緩沖溶液體系中得到的聚合產(chǎn)物.選定DPPH自由基乙醇溶液的濃度為50mg/L，考察了不同濃度的4-溴苯酚聚合物對DPPH自由基的清除率，結(jié)果見圖4.可以看出，該聚合物具有明顯的清除DPPH自由基的能力，其濃度為100mg/L時(shí)，對DPPH自由基的清除率為30.5%，隨4-溴苯酚聚合物濃度的增加，對DPPH自由基的清除率逐漸增大.隨后，我們進(jìn)一步考察了不同濃度的4-溴苯酚聚合物對ABTS陽離子自由基的清除率，結(jié)果見圖5，當(dāng)4-溴苯酚聚合物的濃度為30mg/L時(shí)，對ABTS陽離子自由基的清除率達(dá)到50%以上，顯示出良好的抗氧化性能.

圖4 4-溴苯酚聚合物對DPPH自由基的抑制率Fig.4 Inhibition efficiency of 4-bromophenol polymer to DPPH free radical

圖5 4-溴苯酚聚合物對ABTS陽離子自由基的抑制率Fig.5 Inhibition efficiency of 4-bromophenol polymer to ABTS cation free radical

3 結(jié)論

在辣根過氧化物酶為催化劑、H2O2為氧化劑的條件下，4-溴苯酚在有機(jī)溶劑和緩沖溶液的混合體系中可發(fā)生氧化聚合反應(yīng).有機(jī)溶劑和緩沖溶液的配比對聚合物產(chǎn)率有很大影響.而有機(jī)溶劑的類型及有機(jī)溶劑和緩沖溶液的配比均對聚合產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量有明顯的影響.4-溴苯酚聚合物中含有苯-苯連接和苯-氧連接兩種結(jié)構(gòu)，具有較好的熱穩(wěn)定性.利用酶催化聚合反應(yīng)可以方便地得到4-溴苯酚聚合物，由于分子結(jié)構(gòu)中仍存在大量的酚羥基，該聚合物具有明顯的抗自由基能力，預(yù)示其具有良好的抗氧化性能.因此，本研究為新型抗氧劑的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和合成提供了一種新的思路，同時(shí)也拓寬了酚類化合物酶催化聚合反應(yīng)的應(yīng)用領(lǐng)域.

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