葉秋月，許文兵，劉曉清，張麗帆

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1.國(guó)際醫(yī)療部； 2.呼吸內(nèi)科； 3.感染內(nèi)科, 北京 100730)

T-SPOT.TB在肺結(jié)節(jié)病與肺結(jié)核鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值

葉秋月1，許文兵2*，劉曉清3，張麗帆3

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1.國(guó)際醫(yī)療部； 2.呼吸內(nèi)科； 3.感染內(nèi)科, 北京 100730)

目的通過(guò)T-SPOT.TB檢測(cè)，探討其在肺結(jié)節(jié)病和肺結(jié)核鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法檢測(cè)2008年1月至2011年3月在北京協(xié)和醫(yī)院確診的44例肺結(jié)節(jié)病和30例肺結(jié)核患者并進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果44例肺結(jié)節(jié)病患者T-SPOT.TB陽(yáng)性12例(27.3%)，30例肺結(jié)核患者陽(yáng)性27例(90%)；肺結(jié)節(jié)病患者ESAT-6和CFP-10肽段合并的分泌IFN-γ細(xì)胞頻數(shù)是46 SFCs/106PBMC(IQR 28～204)，顯著低于肺結(jié)核患者565 SFCs/106PBMC(IQR 170～2340)。結(jié)論T-SPOT.TB檢測(cè)有助于鑒別診斷肺結(jié)節(jié)病與肺結(jié)核。

肺結(jié)節(jié)??；肺結(jié)核；鑒別診斷；ELISPOT；T-SPOT.TB

結(jié)節(jié)病是一種病因不明的多系統(tǒng)器官受累的非干酪性類上皮樣肉芽腫性疾病，其與結(jié)核病有許多相似之處，但兩者治療完全不同，鑒別診斷是臨床難題。有Meta分析顯示結(jié)節(jié)病患者組織標(biāo)本中分枝桿菌DNA的檢出率為30%，高于正常健康人群，而亦有結(jié)果相反的研究[1]。中國(guó)是結(jié)核高發(fā)的國(guó)家，在診斷結(jié)節(jié)病時(shí)尤應(yīng)注意除外結(jié)核或合并結(jié)核病。T-SPOT.TB是一項(xiàng)新的診斷結(jié)核感染的免疫學(xué)方法，它是應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)檢測(cè)機(jī)體內(nèi)經(jīng)結(jié)核特異性的RD1區(qū)編碼抗原EAST-6和CFP-10肽段庫(kù)刺激后釋放γ干擾素的特異性T細(xì)胞數(shù)量[2-3]。作為一項(xiàng)新的診斷結(jié)核感染的高敏感性、高特異性檢查，已經(jīng)廣泛地被應(yīng)用于臨床。本研究擬從臨床角度分析T-SPOT.TB作為一項(xiàng)診斷結(jié)核的新技術(shù)能否幫助提高醫(yī)生對(duì)兩種疾病的鑒別診斷。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性選取北京協(xié)和醫(yī)院2008年1月至2011年3月就診的肺結(jié)節(jié)病患者及肺結(jié)核住院患者，肺結(jié)節(jié)病患者及肺結(jié)核患者需滿足以下條件：1) 結(jié)節(jié)病病例均取得病理組織活檢，表現(xiàn)為非干酪樣壞死性肉芽腫，病理形態(tài)及抗酸染色均未發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染的證據(jù)；經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療后癥狀、影像有好轉(zhuǎn)或觀察過(guò)程中影像能自行消散；2)肺結(jié)核病例均符合：a細(xì)菌學(xué)檢查痰或支氣管吸取物、肺組織萋-尼染色陽(yáng)性，或痰及肺組織中MTB(結(jié)核分枝桿菌)快速培養(yǎng)陽(yáng)性；b 肺組織或淋巴結(jié)活檢病理表現(xiàn)為上皮樣肉芽腫伴干酪樣壞死的典型結(jié)核病變，有或無(wú)抗酸染色陽(yáng)性結(jié)果；c 經(jīng)抗結(jié)核治療有效，肺部陰影吸收。同時(shí)具有a+c或b+c者可確診肺結(jié)核病。3)以上患者均獲得知情同意后送檢T-SPOT.TB檢查。

1.2 研究方法

回顧分析兩組病例臨床資料，按設(shè)計(jì)表格收集資料，記錄兩組患者臨床表現(xiàn)、T-SPOT.TB、結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)等結(jié)果。

T-SPOT.TB檢測(cè)按T-SPOT．TB試劑盒操作規(guī)范進(jìn)行。取患者靜脈血4 mL，肝素抗凝，6 h內(nèi)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，用細(xì)胞培養(yǎng)基AIM-V重懸細(xì)胞，并將濃度調(diào)整至2.5×106/mL。在已包被抗IFN-γ單抗的96孔板上，分別單孔加入50 μL細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，50 μL植物血凝素作為陽(yáng)性對(duì)照，分別以50 μL結(jié)核分枝桿菌特異性ESAT-6和CFP-10肽段庫(kù)(終濃度10 mg/L)作為刺激原(Oxford Immunote Ltd.，Oxford, EngLand)。然后在每個(gè)孔中加入100 μL上述細(xì)胞懸液。把96孔板放在37 ℃孵育箱培養(yǎng)16～20 h后，用PBS液洗板4次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，在2～8 ℃下孵育1 h，孵育后再用PBS液洗板4次。最后每孔加入顯色底物液5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽/四氮唑藍(lán)(BCIP/NBTPLUS)，室溫中靜置7 min后去離子水終止反應(yīng)。觀察結(jié)果，并用ELISPOT計(jì)數(shù)儀(AID iSPOT Reader spectrum，ZEISS, Germany)進(jìn)行斑點(diǎn)閱讀與統(tǒng)計(jì)。空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)小于10且陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)大于20時(shí)視為實(shí)驗(yàn)有效。當(dāng)ESAT-6或CFP.10任一檢測(cè)孔達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽(yáng)性結(jié)果：1)如果空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≤5個(gè)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6。2)如果空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)必須gt;2倍的空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。T-SPOT.TB的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用每百萬(wàn)個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中斑點(diǎn)形成細(xì)胞(spot-forming cell，SFC)的個(gè)數(shù)來(lái)描述，每百萬(wàn)個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中斑點(diǎn)形成細(xì)胞lt;24為陰性，≥24為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般情況

本研究入選肺結(jié)節(jié)病患者44例，肺結(jié)核患者30例。肺結(jié)節(jié)病組男11例，女33例；平均年齡(47±11.9)歲，病程3天～17年，中位病程3月(IQR， 2～11.3)。肺結(jié)核病組男18例，女12例；平均年齡(49.1±17)歲。病程15天～7年，中位病程3.5月(IQR，1～12)。

2.2 兩組患者T-SPOT.TB 檢測(cè)結(jié)果分析

肺結(jié)節(jié)病組T-SPOT.TB 檢測(cè)的陽(yáng)性率為27.3%(12/44)，顯著低于肺結(jié)核組的90%(27/30)(Plt;0.001)。肺結(jié)節(jié)病組T-SPOT.TB斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)范圍為0～544 SFCs/106PBMC 和中位數(shù)為46 SFCs/106PBMC(IQR，28～204)；顯著低于肺結(jié)核組的0～7308 SFCs/106PBMC和中位數(shù)為565 SFCs/106PBMC(IQR，170～2340)(Plt;0.001)(計(jì)算T-SPOT.TB中位數(shù)時(shí)剔除了0值)。兩組T-SPOT.TB斑點(diǎn)形成細(xì)胞分布(表1)。

2.3 兩組患者TST檢查結(jié)果分析

44例結(jié)節(jié)病患者中有35例同時(shí)進(jìn)行了TST檢查。TST結(jié)果以硬結(jié)直徑≥10 mm判為陽(yáng)性，TST陽(yáng)性率為11.4%(4/35), T-SPOT.TB陽(yáng)性率為25.7%(9/35)；在肺結(jié)節(jié)病組，T-SPOT.TB陽(yáng)性率較TST無(wú)明顯增高。30例肺結(jié)核患者中有18例同時(shí)進(jìn)行了TST檢查， T-SPOT.TB陽(yáng)性率為88.9%(16/18),顯著高于 TST的陽(yáng)性率55.6%(10/18)(Plt;0.05)。

2.4 治療和預(yù)后

44例結(jié)節(jié)病患者隨訪1～36 m，平均(8.3±6.7)月。其中有13例給予正規(guī)四聯(lián)抗結(jié)核治療1～14 m，平均(6.2±4.3)月，肺內(nèi)異常影像無(wú)吸收改善。有9例結(jié)節(jié)病最初未用藥，臨床觀察中隨訪中8例復(fù)查CT自行緩解，1例縱隔淋巴結(jié)增大遂加用皮質(zhì)激素后肺內(nèi)陰影明顯吸收；25例使用口服強(qiáng)的松初始劑量30～40 mg/d治療，3～36月，平均8.6±7.0月，24例影像有改善，1例最初用藥效果可，后減量過(guò)程中反復(fù)，逐步發(fā)展為IV期結(jié)節(jié)病。有6例給予口服強(qiáng)的松30～40 mg/d同時(shí)予免疫抑制劑，有4例加用MTX 10 mg/w，1例加用依木蘭100 mg/d，1例加用CTX 100 mg/d，6例影像均有改善。有4例單純使用布地奈德粉劑吸入，CT均有不同程度改善。結(jié)節(jié)病組中12例T-SPOT.TB陽(yáng)性患者其中有2例觀察，2例使用布地奈德噴喉，影像均有不同程度改善。8例加用強(qiáng)的松口服，其中6例初始曾單用抗結(jié)核藥時(shí)癥狀、CT改善不明顯，加用皮質(zhì)激素后8例患者中7例癥狀及影像均有明顯改善，1例最初有好轉(zhuǎn)，但減量過(guò)程中有反復(fù)。肺結(jié)核病組30例均給予正規(guī)抗結(jié)核治療，臨床及影像均有好轉(zhuǎn)。

3 討論

結(jié)節(jié)病是非干酪性肉芽腫性疾病，與結(jié)核病同為肉芽腫性疾病，但兩者的治療不同，如何準(zhǔn)確地將兩者區(qū)分極為重要。

長(zhǎng)期應(yīng)用的診斷結(jié)核感染的TST存在許多缺陷，如在普遍接種卡介苗(Bacillus Calmett Guerin, BCG)的地方有很高的“假陽(yáng)性率”；而在免疫低下人群有許多“假陰性”[4]；且TST的操作規(guī)范、結(jié)果判讀主觀性較強(qiáng)，嚴(yán)重影響結(jié)果準(zhǔn)確性。T-SPOT.TB的原理是應(yīng)用ELISPOT檢測(cè)經(jīng)結(jié)核特異性的RD1區(qū)編碼抗原EAST-6和CFP-10肽段庫(kù)刺激后釋放γ干擾素的特異性T細(xì)胞數(shù)量診斷結(jié)核感染。目前已有多個(gè)研究證實(shí)T-SPOT.TB診斷結(jié)核感染有很高的敏感性和特異性[3,5-8]。Meta分析表明T-SPOT.TB的綜合敏感性為90%，綜合特異性為93%[3]。本研究中肺結(jié)核組的T-SPOT.TB的陽(yáng)性率顯著高于TST陽(yáng)性率，充分說(shuō)明了T-SPOT.TB較TST有更好的敏感性。

T-SPOT.TB結(jié)果與結(jié)核菌菌量、疾病活動(dòng)狀態(tài)具有一定的相關(guān)性[9]。本研究中44例肺結(jié)節(jié)病的T-SPOT.TB陽(yáng)性率、EAST-6和CFP-10肽段庫(kù)合并的分泌IFN-γ細(xì)胞頻數(shù)顯著低于肺結(jié)核病組，說(shuō)明T-SPOT.TB可很好的鑒別肺結(jié)節(jié)病和肺結(jié)核；本研究還提示若T-SPOT.TB值小于50，肺結(jié)核可能性小，肺結(jié)節(jié)病可能性大；而T-SPOT.TB值大于50時(shí)，肺結(jié)核可能性大。若T-SPOT.TB值大于600，基本可除外肺結(jié)節(jié)病的診斷。

結(jié)節(jié)病組有12例 (27.3%)的T-SPOT.TB陽(yáng)性。韓國(guó)某研究報(bào)道非結(jié)核病患者T-SPOT.TB陽(yáng)性率為28.5%(39/137),認(rèn)為可能與韓國(guó)高達(dá)30%的潛伏結(jié)核感染有關(guān)[10]；本研究中陽(yáng)性率與其相近，考慮可能與我國(guó)人群中結(jié)核潛伏感染的發(fā)生率高有關(guān)。

表1 肺結(jié)節(jié)病組和肺結(jié)核病組T-SPOT.TB斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)值分布表Table 1 Numerical distribution of T-SPOT.TB spots in sarcoidosis group and pulmonary tuberculosis group

由于結(jié)節(jié)病患者細(xì)胞免疫功能受抑制，故目前國(guó)內(nèi)或國(guó)外均以結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)陰性或弱陽(yáng)性作為結(jié)節(jié)病重要的診斷及鑒別診斷參考指標(biāo)。印度112名結(jié)節(jié)病患者行TST，結(jié)果提示結(jié)節(jié)病患者的TST陽(yáng)性率并不受所處人群(如印度)TST的高陽(yáng)性率影響，所以當(dāng)結(jié)節(jié)病患者感染結(jié)核，TST并不是良好的篩查指標(biāo)[11]。本研究提示T-SPOT.TB能較TST更敏感地篩查出結(jié)節(jié)病患者中的潛伏結(jié)核感染(未發(fā)表資料)，這部分結(jié)節(jié)病患者需要使用皮質(zhì)激素治療時(shí)，是否可參考T-SPOT.TB的值來(lái)決定是否需同時(shí)加用抗結(jié)核治療以減少活動(dòng)性結(jié)核發(fā)生，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述， T-SPOT.TB可作為一項(xiàng)新方法協(xié)同鑒別診斷肺結(jié)節(jié)病與肺結(jié)核，并進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療。

[1] Gupta D，Agarwal R，Aggarwal AN，etal. Molecular evidence for the role of mycobacteria in sarcoidosis: a meta-analysis[J]. Eur Respir J,2007,30: 508-516.

[2] 劉曉清，張麗帆.γ干擾素釋放分析T-SPOT.TB在診斷結(jié)核感染中的應(yīng)用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2010,12：2065-2068.

[3] Pai M, Zwerling A, Menzies D. Systematic review:T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection:an update[J].Ann intern Med,2008,149:177-184.

[4] Lee E，Holzman RS. Evolution and current use of the tuberculin test[J]. Clin Infect Dis,2002,34:365-370.

[5] Ferrara G, Losi M，D’Amico R，etal. Use in routine clinical practice of two commercial blood tests for diagnosis of infection with Mycobacterium tuberculosis: a prospective study[J]. Lancet, 2006,367:1328-1334.

[6] Soysal A,Torun T,Efe S,etal. Evaluation of cut-off values of interferon-gamma-based assays in the diagnosis of M.tuberculosis infection[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2008,12:50-56.

[7] Kang YA, Lee HW, Yoon HI,etal. Discrepancy between the tuberculin skin test and the whole-blood interferon gamma assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection in an intermediate tuberculosis-burden country[J]. JAMA, 2005,293: 2756-2761.

[8] Janssens JP，Roux-Lombard P，Perneger T，etal. Quantitative scoring of an interferon-gamma assay for differentiating active from latent tuberculosis[J]. Eur Respir J,2007,30:722-728.

[9] Carrara S, Vincenti D, Petrosillo N,etal. Use of a T cell-based assay for monitoring efficacy of antituberculosis therapy[J]. Clin Infect Dis,2004,38:754-756.

[10] Young AK, HyeWL, Seung SH,etal. Usefulness of whole-blood Interferon-γenzyme-linked immunospot assay in the diagnosis of active pulmonary tuberculosis[J].Chest,2007,132:959-965.

[11] Gupta D，Chetty M，Kumar N，etal. Anergy to tuberculin in sarcoidosis is not influenced by high prevalence tuberculin sensitivity in the population[J]. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis,2003,20:40-45.

The value of T-SPOT.TB in the differential diagnosis of sarcoidosis and pulmonary tuberculosis

YE Qiu-yue1， XU Wen-bing2*，LIU Xiao-qing3，ZHANG Li-fan3

(1.the International Medical Department; 2.the Respiratory Medical Department;3.the Infectious Diseases Department, PUMC Hospital, CAMS amp; PUMC, Beijing 100730, China)

ObjectiveT-SPOT.TB is a new method to diagnose tuberculous infection through detecting the frequencies of IFN-γ producing T cells which respond to the M.tuberculosis specific antigens encoded by the RD1 region(ESAT-6 and CFP-10). This study aimed to evaluate the role of T-SPOT.TB in the differentiation of the sarcoidosis and tuberculosis.MethodsThe data of T-SPOT.TB of 44 sarcoidosis and 30 pulmonary tuberculosis patients in PUMCH between January 2008 and March 2011 were analysed.ResultsAmong the 44 sarcoidosis patients,the T-SPOT.TB result was positive in 12 patient (27.3%),while among the 30 pulmonary tuberculosis patients,the T-SPOT.TB result was positive in 27 patient (90%).Pooled frequencies of ESAT-6 and CFP-10 specific IFN-γ secreting T cell was 46SFCs/106PBMC(IQR 28～204) for sarcoidosis patients,significantly lower than that for pulmonary tuberculosis patients which was 565 SFCs/106PBMC(IQR 170～2340).ConclusionsT-SPOT.TB is a potential method for the differentiation of sarcoidosis from pulmonary tuberculosis.

sarcoidosis；poulmonary tuberculosis；differential diagnosis；ELISPOT；T-SPOT.TB

2013-04-01

2013-10-28

*通信作者(correspondingauthor)： xuwenbing@qq.com

1001-6325(2014)04-0527-04

研究論文

R 714.253

A