凌 康，柴路維，何曉茜，姜 蓉*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院 普外科； 2.干細胞與組織工程研究室， 重慶 400016)

研究論文

ATF4基因在小鼠動情周期中子宮內(nèi)膜的表達

凌 康1，柴路維2，何曉茜2，姜 蓉2*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院 普外科； 2.干細胞與組織工程研究室， 重慶 400016)

目的探討轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)在小鼠動情周期中子宮內(nèi)膜的表達規(guī)律。方法采用RT-PCR、免疫組織化學(xué)和Western blot法分別檢測小鼠子宮內(nèi)膜中ATF4 mRNA和蛋白在動情前期、動情期、動情間期和動情后期的表達規(guī)律。結(jié)果ATF4 mRNA在動情期表達顯著高于其他3期(Plt;0.05);ATF4蛋白主要在腺上皮細胞和腔上皮細胞胞質(zhì)表達，其表達規(guī)律與RT-PCR的結(jié)果基本一致。結(jié)論ATF4在小鼠動情周期子宮內(nèi)膜中呈動態(tài)表達,提示ATF4可能參與了動情周期子宮內(nèi)膜變化的調(diào)控。

轉(zhuǎn)錄激活因子4;小鼠;動情周期;子宮內(nèi)膜

轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor4,ATF4)是ATF家族的一員,該家族識別順式作用轉(zhuǎn)錄增強子cAMP效應(yīng)元件,是一種包含Jun和Fos結(jié)合位點的DNA結(jié)合蛋白,屬于較大的堿性白氨酸鏈超家族[1]。近年來研究表明它能使腫瘤細胞在乏氧或其他應(yīng)激的腫瘤微環(huán)境中促進細胞存活，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。ATF4基因在腫瘤中的機制主要有抑制細胞的凋亡、促進細胞的增殖和分化、誘導(dǎo)血管的生成[2-5，9]。然而目前國內(nèi)外對于ATF4在妊娠過程中的表達情況仍鮮有報道。本研究采用RT-PCR、免疫組織化學(xué)法和Western blot法分析了ATF4 mRNA和蛋白在小鼠動情周期子宮內(nèi)膜中的表達情況，探討它在生殖過程中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:清潔級KM雌性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量25～30 g[重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(渝) 20050002 ]。室溫22 ℃，光照14 h，10 h黑暗，自由取食、飲水。根據(jù)動情周期分期標(biāo)準(zhǔn)，陰道脫落細胞涂片將未孕小鼠分為動情前期、動情期、動情后期、動情間期4組，每組30只。其中每組隨機選10只分別用于RT-PCR和Western blot實驗，另10只取子宮石蠟包埋，用于免疫組化。

1.1.2 主要試劑：RT-PCR引物由上海生工設(shè)計和合成, RT-PCR試劑(TaKaRa公司)；一抗(兔抗小鼠ATF4抗體)(Proteintech Group公司)；二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG)(Santa cruz公司)；免疫組化試劑盒(北京中山生物公司)；蛋白提取試劑盒(凱基公司)、化學(xué)發(fā)光檢驗試劑盒ECL(上海碧云天公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 RT-PCR：按試劑盒說明提取總RNA，判定 RNA純度及濃度；取部分RNA凝膠電泳，確定其完整性。ATF4基因(NM009716)上游引物：5′-CAA AACAAGACAGCAGCCACTA-3′，下游引物：5′-CTT CTTCCCCCTTGCCTTAC-3′，擴增片段長度為186 bp；內(nèi)對照引物β-actin基因上下游引物分別為：5′-C CTGAGGCTCTTTTCCAGCC-3′,5′-TAGAGGTCTTTA CGGATGTCAACGT-3′，擴增片段長度為110 bp。嚴格按照產(chǎn)品說明操作：將總RNA先反轉(zhuǎn)錄為cDNA。20 μL PCR反應(yīng)體系，先94 ℃變性4 min，然后進入循環(huán)：94 ℃變性30 s， 57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，最后再延伸5 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，圖像分析儀掃描分析并攝像。用Quantity one 4.0軟件分析各條帶吸光度值/mm2，計算各組吸光度比值。

1.2.2 免疫組織化學(xué)：常規(guī)石蠟包埋子宮組織，制備切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，一抗ATF4工作濃度1∶200，操作過程均按組織化學(xué)染色試劑盒說明進行。棕黃色為陽性結(jié)果。對每張切片取10個視野，每份標(biāo)本取5張切片觀察，通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行圖片的平均吸光度分析，測定ATF4蛋白的相對表達量。

1.2.3 Western blot：按照試劑盒說明操作，常規(guī)裂解組織獲取總蛋白、測定蛋白濃度。等量上樣PAGE分離，PAGE分離蛋白用10%的分離膠，5%積層膠；將 PAGE分離的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上；加入一抗、二抗。以ECL化學(xué)發(fā)光試劑在X線片上曝光、顯影、定影。以GAPDH為內(nèi)參。用Quantity One 4.0軟件分析成像圖譜，計算各組小鼠子宮內(nèi)膜ATF4蛋白的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR產(chǎn)物定性與半定量分析

ATF4基因在小鼠動情周期各期子宮內(nèi)膜均有表達，在動情期其表達明顯高于其他3期(Plt;0.01),其他3組間無顯著差異(圖1)。

*Plt;0.01 compared with estrus group圖1 動情周期各期 ATF4 mRNA的相對表達Fig 1 Expression of ATF4 mRNA during the estrus cycle

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

ATF4在動情周期各期小鼠子宮內(nèi)膜組織中均有表達?？梢娮攸S色陽性物質(zhì)主要分布于內(nèi)膜腔上皮和腺上皮胞質(zhì)。動情期與其他3期相比表達明顯增強(Plt;0.05), 其他3組之間無明顯差異(圖2)。

A.proestrus; B.estrus; C.metestrus; D.diestrus; E.control圖2 ATF4 在動情周期小鼠子宮內(nèi)膜的表達Fig 2 Expression of ATF4 in mouse endometrium during the estrus cycle(×200)

2.3 Western blot結(jié)果

ATF4在動情周期各期小鼠子宮內(nèi)膜組織中均有表達,動情期與其他3期相比表達明顯增強(Plt;0.05), 其他3組之間無明顯差異(圖3)。

3 討論

ATF4最早在低氧組織被發(fā)現(xiàn)，是一種應(yīng)激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)發(fā)生缺氧時,蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)被激活,通過磷酸化真核細胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)抑制蛋白質(zhì)合成并活化ATF4, 繼而上調(diào)C-EBP同源蛋白(C-EBP homologous protein,CHOP)基因表達,啟動細胞增殖，使細胞適應(yīng)缺氧環(huán)境[6-7]。

圖3 ATF4在動情周期小鼠子宮內(nèi)膜的Westernblot成像圖 Fig 3 Imaging of ATF4 protein in mouse endometrium during the estrus cycle by Western blot

雌性成年小鼠的動情周期一般為 4～5 d, 可分為動情前期、動情期、動情后期、動情間期 4 個不同的時期, 子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)及功能在這4 個階段都將發(fā)生一系列的改變。本實驗結(jié)果顯示：ATF4 mRNA和蛋白在小鼠動情周期子宮內(nèi)膜中的表達呈規(guī)律性變化,在動情期表達明顯增強,其他3期間無顯著性差異。ATF4蛋白主要表達在子宮內(nèi)膜腔上皮細胞和腺上皮細胞胞質(zhì)。

正常小鼠血漿雌激素水平在動情前期開始上升, 至動情期達到高峰, 此期細胞不斷分裂增殖、發(fā)生排卵并接受交配, 隨后子宮內(nèi)膜的環(huán)境變得有利于胚胎的植入[8]。近年來研究表明，在多種惡性腫瘤中ATF4基因能使腫瘤細胞在應(yīng)激的腫瘤微環(huán)境中啟動細胞增殖，促進細胞存活[2-5]。本研究中ATF4在動情期高表達，與這一時期雌激素變化一致，因此推測ATF4可能是受到雌激素、孕激素等卵巢激素的調(diào)控而高表達，從而有利于細胞大量增殖分化。此期若未受精依次進入動情后期、間期,子宮隨即開始縮小、內(nèi)膜萎縮，ATF4的表達亦迅速降低。

此外，據(jù)相關(guān)文獻報道，ATF4通過調(diào)控其下游基因血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達而在血管生成和生長中發(fā)揮作用。如在乳腺癌細胞中，ATF4被激活后誘導(dǎo)VEGF促進腫瘤新生血管的形成[9]。在修復(fù)血管損傷實驗中[10-12]，ATF4通過誘導(dǎo)VEGF的表達可使損傷的血管內(nèi)膜增厚，且過表達的ATF4在血管損傷后能刺激平滑肌細胞增殖。結(jié)合我們的實驗結(jié)果,動情期雌激素水平迅速達到峰值，在雌激素水平的作用下,細胞增殖分裂活躍，間質(zhì)出現(xiàn)水腫，壓迫上皮組織，使子宮內(nèi)膜處于相對缺氧狀態(tài)，此時ATF4表達比其他組顯著增加,可能是由于應(yīng)激作用導(dǎo)致PERK磷酸化從而激活elF2α-ATF4途徑，導(dǎo)致ATF4蛋白活化表達上調(diào)，從而誘導(dǎo)VEGF促進子宮內(nèi)膜血管形成和血管平滑肌細胞的增殖分化，最終形成有利于著床的子宮內(nèi)環(huán)境，為胚胎植入做好準(zhǔn)備。

總之，本研究初步探討了ATF4基因在小鼠動情周期子宮內(nèi)膜的表達模式,為進一步探討此分子在雌性生殖中的作用提供了依據(jù)。

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Expression of ATF4 in mouse endometrium during the estrus cycle

LING Kang1, CHAI Lu-wei2, HE Xiao-xi2, JIANG Rong2*

(1.Dept. of General Surgery, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University;2.Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering, Chongqing Medical University, Chongqing 400016,China)

ObjectiveTo investigate the expression pattern of ATF4 in mouse endometrium during the estrus cycle.MethodsReverse transcription polymerase chain reaction (RT- PCR), immunohistochemistry and Western blotting were used to detect the expression of ATF4 mRNA and protein in mouse endometrium during at each stage of the estrus cycle.ResultsATF4 mRNA expression in estrus stage was higher than those of the other 3 stages, and there was significant difference between estrus stage and the other 3 groups (Plt;0.05). The prominent expression of ATF4 protein was primarily limited to the glandular epithelium cell and luminal epithelium cell cytoplasm in the endometrium. Expression of ATF4 protein was similar with that of the mRNA.ConclusionsATF4, expressed in endometrium periodically in the estrus cycle, might play an important role in endometrial cyclical variation during the estrus cycle.

ATF4;mice;estrus cycle;endometrium

2013-02-18

2013-06-03

重慶市教委課題(KJ110307)

*通信作者(correspondingauthor)： ganxibaoyanjiushi@126.com

1001-6325(2014)01-0078-04

R 394

A