羅二梅， 張家文，胡笑軻，唐明喬，宇 麗*

(暨南大學(xué) 1.醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)系； 2.理工學(xué)院 土木工程系， 廣東 廣州 510632)

研究論文

共培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)和兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)hUC-MSCs分化成軟骨細(xì)胞

羅二梅1， 張家文1，胡笑軻1，唐明喬2*，宇 麗1*

(暨南大學(xué) 1.醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)系； 2.理工學(xué)院 土木工程系， 廣東 廣州 510632)

目的探討兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)的共培養(yǎng)對hUC-MSCs成軟骨誘導(dǎo)分化的影響及共培養(yǎng)的最佳比例。方法分離培養(yǎng)hUC-MSCs和兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并鑒定其特異性。在Transwell體系中，按1∶4，1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1及4∶1 的比例(hUC-MSCs：兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞)共培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)與增殖；甲苯胺藍(lán)染色及免疫熒光染色分別檢測葡萄糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型膠原(COL2A1)(蛋白水平定性)；并對各組細(xì)胞爬片進行GAG、COL2A1定量檢測；同時用實時定量熒光PCR(pPCR)檢測GAG、COL2A1 mRNA表達(dá)，觀察共培養(yǎng)前后細(xì)胞的基質(zhì)分泌情況。結(jié)果共培養(yǎng) 21 d 后，陽性對照組和實驗組細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色及免疫熒光反應(yīng)均呈陽性；GAG、COL2A1含量及mRNA表達(dá)量1∶4實驗組均要高于其他實驗組和陽性對照組。結(jié)論hUC-MSCs和兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的共培養(yǎng)可明顯促進hUC-MSCs向軟骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，且最佳共培養(yǎng)比例為1∶4。

Transwell小室；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；共培養(yǎng)；成軟骨誘導(dǎo)

近年來，細(xì)胞生物學(xué)和生物材料技術(shù)的高速發(fā)展使組織工程在軟骨缺損修復(fù)中的治療應(yīng)用成為可能[1]。目前，軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞都被認(rèn)為可用于構(gòu)造新生軟骨組織。但軟骨細(xì)胞表型不易維持，容易去分化，因此，其臨床應(yīng)用性受到限制。有研究表明，與軟骨細(xì)胞相比，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell, hUC-MSCs)極易分離得到，且患者沒有創(chuàng)傷，因此是另一種重要的種子細(xì)胞來源[2-3]。傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方法需要生長因子和(或者)基因運輸系統(tǒng)來促進細(xì)胞生長，費用高，難以有效應(yīng)用于臨床，因此，共培養(yǎng)成為另一種新型的誘導(dǎo)方法[4]。受國外學(xué)者將Transwell小室用于促進內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞增殖及用于誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞等的啟發(fā)[5-6]，本實驗采用Transwell小室進行hUC-MSCs和兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的相隔共培養(yǎng)，探討hUC-MSCs與兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的最佳比例，為軟骨組織工程研究尋找一種新的種子細(xì)胞獲取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用新生兒臍帶(n=4)，取自暨南大學(xué)華僑醫(yī)學(xué)院，產(chǎn)婦體健，足月剖宮產(chǎn)，產(chǎn)婦及其家屬均簽署知情同意書，實驗方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會批準(zhǔn)。新西蘭大白兔均由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，3～4周齡，雄性，清潔型。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[7]。主要試劑：膠原蛋白酶Ⅱ、胰蛋白酶、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲苯胺藍(lán)和阿利新藍(lán)(Sigma公司)，維生素C(Amrersco公司)、T25培養(yǎng)瓶和Transwell小室(Corning公司)，成骨誘導(dǎo)試劑盒和成脂肪誘導(dǎo)試劑盒(CYAGEN公司)，DMEM/F12培養(yǎng)液、DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清(Gibco公司)，TGF-β1(PeproTech公司)，地塞米松，青霉素和鏈霉素(Hyclone公司)，總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和real-time PCR試劑盒(TIANGEN公司)，引物(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSCs的原代及傳代培養(yǎng)：無菌條件下，取臍帶3～5 cm，膠原蛋白酶Ⅱ消化，過濾，離心，收集細(xì)胞培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%～90%匯合時，消化離心后加入新的培養(yǎng)基置37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.2 hUC-MSCs的表面標(biāo)志物及hUC-MSCs誘導(dǎo)分化潛能檢測：已發(fā)表文章[8]。

1.2.3 兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)：無菌條件下，取新西蘭大白兔(n=4)雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，胰蛋白酶和膠原酶Ⅱ消化后過濾，離心，棄上清，收集軟骨細(xì)胞，接種于新的培養(yǎng)瓶。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合時，消化、傳代成第1代細(xì)胞，置37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 hUC-MSCs和兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)：取對數(shù)增殖期的第3代hUC-MSCs和第2代兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，接種于放有多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片的Transwell共培養(yǎng)體系中，上室為兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，下室為hUC-MSCs，按表1所示比例共培養(yǎng)。以單獨培養(yǎng)hUC-MSCs為陰性對照，以hUC-MSCs的基本軟骨誘導(dǎo)為陽性對照。待細(xì)胞長至80%～90%匯合時，陽性對照組加入成軟骨基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；實驗組用DMEM高糖溶液繼續(xù)培養(yǎng)；陰性對照組仍用DMEM/F12培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

表1 hUC-MSCs和兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的共培養(yǎng)比例Table 1 Mixture ratio of hUC-MSCs and Rabbit articular chondrocytes

1.2.5 GAG和COL2A1的定性檢測：共培養(yǎng)21 d后，將細(xì)胞爬片沖洗1次，多聚甲醛固定，甲苯胺藍(lán)染色；PBS 沖洗至背景干凈，晾干，中性樹脂封片，觀察并拍照。共培養(yǎng)21d后，將細(xì)胞爬片洗2次，多聚甲醛固定，PBS洗3次，Triton X-100透膜處理，PBS洗3次，牛血清白蛋白(BSA)室溫濕盒封閉30 min。PBS洗2次，一抗4 ℃孵育過夜(溶度為1∶100)。PBS洗3次，二抗室溫避光孵育60 min(溶度為1∶64)。PBS洗3次，去離子水洗3次，熒光抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6 GAG和COL2A1的定量檢測：收集共培養(yǎng)及基本軟骨誘導(dǎo)7、14和21 d的細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞進行GAG和COL2A1的定量檢測。GAG定量采用阿利新藍(lán)法[9]。各組標(biāo)本用木瓜蛋白酶消化，消化產(chǎn)物加入阿利新藍(lán)溶液后測定其吸光度值。羥脯氨酸測定試劑盒檢測COL2A1定量，按說明書進行，最后在酶標(biāo)儀560nm波長處測定吸光度值。

1.2.7 定量PCR檢測GAG和COL2A1 mRNA表達(dá)：取第3代hUC-MSCs、共培養(yǎng)前后及誘導(dǎo)分化后的hUC-MSCs用real-time PCR試劑盒進行實時定量PCR 檢測。先提取總RNA，取1 μg總RNA用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為qPCR的模板。用GADPH作為內(nèi)參。所有樣本的結(jié)果以GADPH的表達(dá)做相對定量分析。數(shù)據(jù)分析采用△△Ct方法[10]，相對表達(dá)量=2-ΔΔCt=2-(△Ct實驗組-△Ct對照組)=2-[(Ct實驗組-Ct內(nèi)參) - (Ct對照組-Ct內(nèi)參)]，數(shù)據(jù)取4次重復(fù)實驗的平均值。所使用引物序列見表2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs表面標(biāo)志物及誘導(dǎo)分化潛能的檢測

hUC-MSCs表面標(biāo)志物的檢測及多向誘導(dǎo)分化潛能結(jié)果表明，我們所分離的干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，見已發(fā)表的文章[8]。

2.2 GAG和COL2A1的定性檢測

陽性對照組和實驗組的下室細(xì)胞(原h(huán)UC-MSCs)甲苯胺藍(lán)染色均強陽性，胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)被染成紫藍(lán)色，而陰性對照組的下室細(xì)胞沒有著色 (圖1)。陰性對照組hUC-MSCs免疫熒光染色呈陰性表達(dá)，而陽性對照組和實驗組的下室細(xì)胞染色均強陽性，胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)均呈現(xiàn)綠色熒光(圖1)。

2.3 GAG和COL2A1的定量檢測

誘導(dǎo)7、14和21 d后，陰性對照組(hUC-MSCs組)GAGA600 nm值在每個時間點都遠(yuǎn)低于其他組(Plt;0.05)。實驗組1∶4，1∶3和1∶2 GAGA600 nm值明顯高于陽性對照組(hUC-MSCs基本誘導(dǎo))，其中，又以1∶4組最顯著(Plt;0.05) (圖3A)。GAGA600 nm值隨著時間的延長而增加。誘導(dǎo)7、14和21 d后，陰性對照組(hUC-MSCs組)羥脯氨酸含量均低于其他組。實驗組1∶4，1∶3，和1∶2羥脯氨酸含量均高于陽性對照組(hUC-MSCs基本誘導(dǎo))，其中，1∶4組第21天時羥脯氨酸含量最顯著(Plt;0.05)(圖3B)。羥脯氨酸含量隨時間的延長而增加。

2.4 實時定量PCR檢測GAG和COL2A1的mRNA表達(dá)

與陰性對照組相比，實驗組1∶4，1∶3和1∶2其GAGmRNA表達(dá)量均高于陽性對照組(Plt;0.05)。其中，1∶4 組在第21天時相對表達(dá)量最高 (Plt;0.05)(圖4A)。實驗組1∶4和1∶3COL2A1 mRNA表達(dá)量均高于陽性對照組(Plt;0.05)。同樣，1∶4組在第21天時相對表達(dá)量最高(Plt;0.05)(圖4B)。GAG和COL2A1 mRNA的相對表達(dá)量均隨時間的延長而增加。

表2 GAG和COL2A的實時定量PCR引物序列Table 2 Real-time quantitative PCR primer sequence of human GAG and COL2A1

A.hUC-MSCs; B.the basic induction of hUC-MSCs; C.1∶4; D.1∶3; E.1∶2; F.1∶1; G.2∶1; H.3∶1; I.4∶1圖1 共培養(yǎng)21 d后甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果Fig 1 The result of Toluidine blue staining after cocutturing for 21 days(×10)

A.hUC-MSCs; B.the basic induction of hUC-MSCs; C.1∶4; D.1∶3; E.1∶2; F.1∶1; G.2∶1; H.3∶1; I.4∶1圖2 共培養(yǎng)21 d后免疫熒光鑒定結(jié)果Fig 2 The result of immunofluorescece staining of coculturing for 21 days(×100)

3 討論

本研究的hUC-MSCs通過Ⅱ型膠原酶消化臍帶得到，高表達(dá)CD29、CD44和CD105，而其CD31、CD34、CD40、CD45和HLA-DR均低表達(dá)或不表達(dá)，且前期的流式細(xì)胞儀檢測周期結(jié)果顯示[8]，大部分hUC-MSCs處于G0/G1期，其余hUC-MSCs均處于增殖分裂期，說明hUC-MSCs處于為分化的狀態(tài)。茜素紅染色、油紅O染色以及Alcian blue 染色進一步說明hUC-MSCs具有向成骨、成脂肪和成軟骨誘導(dǎo)分化的能力，和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞一致，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性[11]。

軟骨細(xì)胞具有分泌作用，可分泌骨形態(tài)蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子等[12]。早有文獻(xiàn)報道，其分泌的細(xì)胞因子可以促進間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化[13]。本實驗將兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與hUC-MSCs共培養(yǎng)，結(jié)果顯示實驗組上層細(xì)胞Alcian blue染色和甲苯胺藍(lán)染色檢測成陽性，提示實驗組上層細(xì)胞能夠分泌成軟骨細(xì)胞特異性表達(dá)，證實是軟骨細(xì)胞。

本實驗引進Transwell膜、通過Transwell小室實現(xiàn)軟骨細(xì)胞與hUC-MSCs的共培養(yǎng)。Transwell膜，聚酯材料，孔徑≤3.0 μm，這種膜允許生物大分子自由通過膜的微孔隙，而細(xì)胞不可能通過膜的微孔隙，而且選用的聚酯膜為鏡下透明膜，故對鏡下的直接觀察不產(chǎn)生影響[7-8]。所以Transwell膜的引進，完全可以實現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與hUC-MSCs的共培養(yǎng)，又可以清晰、明了、簡單地獲取實驗結(jié)果。

A.the quantitative detection of the content of glycosaminoglycan; B.the quantitative detection of the content of hyelroxy proline;*Plt;0.05 compared with the basic induction group (positive group)

A.the expression level of GAG; B.the expression level of COL2A1;*Plt;0.05 compared with the basic induction group (positive group)

在本研究中，甲苯胺藍(lán)染色和免疫熒光染色表明各實驗組中均有GAG和COL2A1的分。GAG和COL2A1為軟骨細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)，兩者的存在說明有成軟骨樣細(xì)胞的產(chǎn)生。GAG和COL2A1的含量檢測結(jié)果顯示，實驗組1∶4其GAG和COL2A1的含量顯著高于陽性對照組和其他實驗組。qPCR檢測軟骨細(xì)胞GAG、COL2A1 mRNA的表達(dá)，提示實驗組與陽性對照組細(xì)胞GAG、COL2A1表達(dá)成陽性，進一步證實實驗組hUC-MSCs已向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，實驗組1∶4的GAG、COL2A1含量顯著高于陰性對照組。

綜上所述，一定比例的Transwell 共培養(yǎng)可明顯增強hUC-MSCs的成軟骨誘導(dǎo)分化的能力。而且，從本研究中可知hUC-MSCs與兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的最佳Transwell 共培養(yǎng)比例為1∶4。但hUC-MSCs分化為軟骨細(xì)胞的具體機制還需進一步研究。

[1] Tsuchiya K, Chen G, Ushida T,etal. The effect of coculture of chondrocytes with mesenchymal stem cells on their cartilaginous phenotypeinvitro[J]. Materials Science and Engineering, 2004, 24: 391-396.

[2] 張玉琳. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抑制同種異體臍血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化. 2012, 32: 930-934.

[3] 范存剛，周景儒，張慶俊. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)研究進展[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床. 2010, 30: 215-218.

[4] Andrea R, Elizabeth Y, James P. Andry MD,etal. Coculture of engineered cartilage with primary chondrocytes induces expedited growth[J]. Clin Orthop Relat Res, 2011, 469:2735-2743.

[5] Nam MH, Lee HS, Seomun Y,etal. Monocyte-endothelium-smooth muscle cell interaction in co-culture: proliferation and cytokine productions in response to advanced glycation end products [J].Biochim Biophys Acta, 2011, 1810:907-912.

[6] Song KD, Li WF, Wang H,etal. Investigation of coculture of human adipose-derived stem cells and mature adipocytes [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2012, 167:2381-2387.

[7] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals, 2006-09-30.

[8] 羅二梅, 宇麗, 張家文, 等. 還原型谷胱甘肽對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)的影響[J]. 中國組織工程雜志. 2013，33: 1-8.

[9] Bj?rnsson S. Simultaneous preparation and quantitation of proteoglycans by precipitation with alcian blue [J]. Anal Biochem, 1993, 210: 282-291.

[10] Tichopad A, Dilger M, Schwarz G,etal. Standardized determination of real-time PCR efficiency from a single reaction set-up [J]. Nucleic Acids Res, 2003, 31: e122.

[11] Ramasamy R, Tong CK, Yip WK,etal. Basic fibroblast growth factor modulates cell cycle of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells [J]. Cell Prolif, 2012, 45, 132-139.

[12] Hoff P, Buttgereit F, Burmester CR,etal. Osteoarthritis synovial fluid activates pro-inflammatory cytokines in primary human chondrocytes [J]. Int Orthop, 2013, 37:145-151.

[13] Tan AR, Dong EY, Andry JP,etal. Coculture of engineered cartilage with primary chondrocytes induces expedited growth [J]. Clin Orthop Relat Res, 2011, 469:2735-2743.

Human umbilical cord mesenchymal stem cells are inducedto differentiate into chondrocytes by co-culture with rabbit chondrocytes

LUO Er-mei1, ZHANG Jia-wen1, HU Xiao-ke1, TANG Ming-qiao2*, YU Li1*

(1.Dept. of Biochemistry, Medical College;2.Dept.of Civil Engineering College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

ObjectiveTo determine if the co-culture of rabbit articular chondrocytes and hUC-MSCsinvitrocan affect differentiation of hUC-MSCs into cartilage-like cells, especially chondrocytes, and if so, what the optimal ratio of the two cell types is.MethodsTo co-culture rabbit articular chondrocytes and hUC-MSCs at a chondrocyte: hUC-MSCs ratio of 4∶1, 3∶1, 2∶1, 1∶1, 1∶2, 1∶3,1∶4 for 21 days and cultured in DMEM high glucose medium. Type Ⅱcollagen (COL2A1) and glycosaminoglycan (GAG) were analyzed qualitatively by toluidine blue and immunofluorescence technique, respectively. The contents of COL2A1 and GAG were estimated from the determination of hydroxyproline content and Alcian Blue method separately. The mRNA expressions ofGAGandCOL2A1 were assayed by real-time fluorescence quantitative PCR.ResultsThe expression ofCOL2A1 andGAGon day 21 was much higher in the 4∶1, 2∶1, and 1∶1 groups than in other the experimental group or the induced hUC-MSCs group. Also on day 21, the expression of COL2A1 and GAG proteins in the 4∶1 group was much higher than that in all other groups.ConclusionsThe optimal cell ratio in Transwell co-culture system appears to be 1∶4 (hUC-MSCs:chondrocytes).

transwell co-culture system; human umbilical cord mesenchymal stem cells; rabbit knee articular chondrocytes; co-culture; chondrogenic induction

2013-03-08

2013-06-17

廣東省自然科學(xué)基金(9151008901000050)

*通信作者(correspondingauthor)： doctoryuli@yahoo.com.cn; tmqtmq@jnu.edu.cn

1001-6325(2014)01-0082-06

Q 254

A