董 賀,馬艷妮,董 磊,趙華路,張俊武,王 芳,余 佳
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 國家醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005)
miR- 29a和miR- 142- 3p促進(jìn)髓系分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
董 賀,馬艷妮,董 磊,趙華路,張俊武,王 芳,余 佳*
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 國家醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005)
目的深入了解miR- 29a/miR- 142- 3p參與促進(jìn)髓系分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。方法首先實(shí)現(xiàn)miR- 29a和miR- 142- 3p在HL- 60細(xì)胞中的過表達(dá),同時(shí)使用PMA以及ATRA分別誘導(dǎo)HL- 60細(xì)胞向單核及粒系分化。May-Grünwald-Giemsa染色方法觀察核形態(tài)變化,Real-time PCR檢測細(xì)胞內(nèi)CD11和CD14的表達(dá)。mRNA表達(dá)譜芯片分析獲得表達(dá)模式相似的基因,利用DAVID和GeneMANIA進(jìn)行GO categories 和信號(hào)通路歸類分析。PicTar和TargetScan進(jìn)行靶基因預(yù)測,雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定靶基因的真實(shí)性。結(jié)果miR- 29a/miR- 142- 3p過表達(dá)細(xì)胞與PMA/ATRA誘導(dǎo)分化細(xì)胞在整體基因表達(dá)模式上有較高的相似度,而表達(dá)模式相似的基因大多與細(xì)胞分化相關(guān),且在GO分析中顯著富集。同時(shí),ZBTB5、CaMKK2、SUV420H2、TRIB2和CANX被確定為miR- 29a新的靶基因。結(jié)論miR- 29a/miR- 142- 3p通過調(diào)節(jié)其靶基因活性,引發(fā)整個(gè)基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的改變,使之趨向于髓系分化過程中的基因表達(dá)變化,從而促進(jìn)髓系分化進(jìn)程。
miR- 29a; miR- 142- 3p; 髓系分化;基因表達(dá); GO分析
造血是貫穿人一生的重要生理過程,涉及多潛能造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSC)的自我更新和向不同鏈系細(xì)胞的分化決定并進(jìn)一步分化發(fā)育成熟。HSC首先分化成共同淋巴樣祖細(xì)胞(common lymphoid progenitor, CLP)和共同髓樣祖細(xì)胞(common myeloid progenitor, CMP)。CMP進(jìn)一步分化成巨核/紅系雙潛能祖細(xì)胞(megakaryocytic-erythroid progenitor, MEP)和粒系/單核系祖細(xì)胞(granulocyte-monocyte progenitor, GMP)。GMP經(jīng)過髓樣分化細(xì)胞限制的途徑分化發(fā)育成粒細(xì)胞、單核細(xì)胞,這一過程又稱為髓系分化[1- 2]。miRNAs是一類大小約為22 nt RNA序列的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)分子。其主要通過互補(bǔ)結(jié)合到靶mRNA 3′非編碼區(qū),剪切mRNA或抑制mRNA的翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[3- 4]。miR- 29a與miR- 142- 3p是本實(shí)驗(yàn)室已證明的兩個(gè)促進(jìn)髓系分化進(jìn)程的miRNA分子[5]。本研究將通過對(duì)基因表達(dá)譜的系統(tǒng)性分析和新的靶基因鑒定探究miR- 29a和miR- 142- 3p這兩個(gè)miRNAs在髓系分化過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),即從整個(gè)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的角度來闡述miR- 29a和miR- 142- 3p促進(jìn)髓系分化的分子機(jī)制。
1.1 主要試劑
HL- 60細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心),Trizol及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司),實(shí)時(shí)定量PCR所用試劑(Takara公司),轉(zhuǎn)染試劑LIPOFECTAMINETM2000 Reagent(Invitrogen公司),May- Grünwald染料(Sigma公司),Giemsa染料(AppliChem公司),Dharmafect Ⅰ轉(zhuǎn)染試劑、miRNA模擬物(Dharmacon公司),雙熒光檢測試劑盒(Promega公司)。
1.2 細(xì)胞系的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
人早幼粒白血病細(xì)胞系HL- 60細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI- 1640培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)前1天更換新鮮的完全培養(yǎng)基,第2天向其加入3 μmol/L ATRA誘導(dǎo)向粒系分化,或加入75 ng/mL PMA誘導(dǎo)向單核-巨噬細(xì)胞分化。
1.3 HL- 60細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染前1天,以適合密度傳代細(xì)胞。將5 μL濃度為20 nmol/L的miRNA模擬物以及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照加入200 μL 無血清培養(yǎng)基中混勻,轉(zhuǎn)染試劑Dharmafect Ⅰ加入200 μL 無血清培養(yǎng)基中,室溫靜置5 min。將混合物直接加入6孔板的細(xì)胞中,輕搖混勻,繼續(xù)培養(yǎng)24~48 h。
1.4 細(xì)胞誘導(dǎo)向粒系或單核-巨噬細(xì)胞分化的檢測
1.4.1 Real time PCR檢測細(xì)胞內(nèi)CD11和CD14的表達(dá):方法見1.5 Real time PCR。
1.4.2 May-Grünwald-Giemsa染色觀察核形態(tài)變化:收集細(xì)胞,4 ℃預(yù)冷的PBS洗1次,重懸于微量的血清中。 細(xì)胞懸液滴于載玻片一側(cè),蓋玻片貼近細(xì)胞懸液,快速拉往另一側(cè),空氣中迅速晾干。 甲醇固定10 min。May-Grünwald染液染色5 min,pH 8左右的去離子水洗5 min。 Giemsa染液中染色10 min,再用水洗涂片3遍。 分析單核-巨噬細(xì)胞和粒系細(xì)胞分化的細(xì)胞形態(tài)。
1.5Real-timePCR檢測細(xì)胞內(nèi)CD11b和CD14的表達(dá)/miR-29a和miR-142-3p的表達(dá)
在分化的不同時(shí)間點(diǎn)或轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞,根據(jù)Trizol操作說明提取細(xì)胞總RNA。提取的總RNA定量后,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。使用適量的cDNA作為PCR模板,BioRad CFX-96進(jìn)行PCR反應(yīng),SYBR染料實(shí)時(shí)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的量,以GAPDH為內(nèi)參(miRNA real-time PCR以U6snRNA為內(nèi)參)分析基因表達(dá)情況。所使用引物序列見表1。
1.6 基因表達(dá)譜的分析
1.6.1 基因表達(dá)模式相似性的分析:以cutoff=2從基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)中篩選出組內(nèi)差異表達(dá)基因,即實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組大于2,為上調(diào);實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組小于等于2且大于等于0.5,為不變;實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組小于0.5,為下調(diào)。進(jìn)而統(tǒng)計(jì)miR- 29a/miR- 142- 3p過表達(dá)組與誘導(dǎo)髓系分化組表達(dá)模式相同的基因數(shù)量占miRNA過表達(dá)組差異表達(dá)基因總數(shù)的比例,計(jì)算表達(dá)模式的相似度。
1.6.2 表達(dá)模式相似基因的GO及信號(hào)通路的分析:以cutoff=3從基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)中篩選出組內(nèi)差異表達(dá)基因,并從中篩選出在miR- 29a/miR- 142- 3p過表達(dá)組與誘導(dǎo)髓系分化組中共同上調(diào)或下降的基因。將這些基因在DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)中進(jìn)行Functional Annotation Clustering分析(主要為GO分析),其中Classification Stringency設(shè)定為“高”。這些基因按照具有相似功能的原則被分為若干組,并根據(jù)其功能之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行排名。對(duì)于排名第1的組中的基因進(jìn)一步通過GeneMANIA(http://www.genemania.org/)進(jìn)行信號(hào)通路分析。
1.7 靶基因的預(yù)測
以cutoff=2從miR- 29a過表達(dá)細(xì)胞的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)中篩選出在miR- 29a過表達(dá)后表達(dá)沒有明顯變化或表達(dá)下調(diào)的基因,并與兩個(gè)靶基因預(yù)測網(wǎng)站(TargetScan和PicTar)所預(yù)測的miR- 29a的候選靶基因進(jìn)行疊加,選擇其中與細(xì)胞分化或增殖相關(guān)的基因作為最終的候選靶基因。
1.8 雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測miR- 29a的候選靶基因
設(shè)計(jì)引物包含預(yù)測靶基因3′UTR區(qū)域的miRNA結(jié)合位點(diǎn)(表2),將 3′UTR區(qū)含miR- 29a結(jié)合位點(diǎn)的300~500 bp序列克隆插入pmiR- reporter載體中,同時(shí)構(gòu)建含與miR- 29a序列完全互補(bǔ)片段的pmiR- reporter作為陽性對(duì)照。所使用引物見表2。0.4 μg pmiR- reporter質(zhì)粒、0.02 μg pRL-TK與5 pmol/L miRNA模擬物或隨機(jī)寡核苷酸對(duì)照共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,按照雙熒光檢測試劑盒說明書操作,檢測報(bào)告基因表達(dá)水平。
2.1HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化以及miR-29a/miR-142-3p的過表達(dá)
如圖1A所示,在HL- 60細(xì)胞中過表達(dá)miR- 29a和miR- 142- 3p,同時(shí)分別誘導(dǎo)HL- 60細(xì)胞向單核及粒系分化。對(duì)誘導(dǎo)分化以及這兩個(gè)miRNAs過表達(dá)后的細(xì)胞的整體基因表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)性分析,并對(duì)基因表達(dá)模式相似的基因進(jìn)行了深入的GO分析和信號(hào)通路分析。另外,鑒定了在這一過程中發(fā)揮重要作用的miR- 29a新的靶基因。以期更加深入地了解miR- 29a/miR- 142- 3p參與促進(jìn)髓系分化的機(jī)制。
表1 Real-time PCR引物Table 1 Primer sequences used for real-time PCR
表2 雙熒光報(bào)告基因所用引物Table 2 Primer sequences used for double-luciferase reporter assay
HL- 60細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)72 h后,細(xì)胞形態(tài)顯著變化,成熟單核細(xì)胞比例增加,即細(xì)胞系呈腎型,胞質(zhì)染色青藍(lán)色的細(xì)胞比例增加(圖1B),同時(shí)單核細(xì)胞分化標(biāo)志基因CD14的表達(dá)明顯增加(圖1C)。HL- 60細(xì)胞經(jīng)ATRA誘導(dǎo)72 h后細(xì)胞形態(tài)顯著變化,成熟粒細(xì)胞比例增加,即細(xì)胞系呈帶狀或分葉,核質(zhì)比明顯減小(圖1B),同時(shí)粒系分化標(biāo)志基因CD11b的表達(dá)明顯增加(圖1C)。另外使用miR- 29a和miR- 142- 3p模擬物轉(zhuǎn)染HL- 60細(xì)胞,PCR結(jié)果顯示miR- 29a和miR- 142- 3p均成功過表達(dá)(圖1D)。
2.2過表達(dá)miR-29a/miR-142-3p及PMA/ATRA誘導(dǎo)分化后基因表達(dá)模式分析
分析結(jié)果顯示,向HL- 60細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR- 29a/miR- 142- 3p模擬物所引起整個(gè)基因表達(dá)模式的變化確實(shí)與HL- 60細(xì)胞在PMA和ATRA的誘導(dǎo)下分別向單核和粒細(xì)胞方向分化的過程中,所引起的基因表達(dá)模式變化有一定的相似性(圖2)。過表達(dá)miR- 29a與ATRA誘導(dǎo)粒系分化后的HL- 60細(xì)胞基因表達(dá)模式相似度為16%;過表達(dá)miR- 29a與PMA誘導(dǎo)單核分化后的HL- 60細(xì)胞基因表達(dá)模式相似度為7%;過表達(dá)miR- 142- 3p與ATRA誘導(dǎo)粒系分化后的HL- 60細(xì)胞基因表達(dá)模式相似度為15%;過表達(dá)miR- 142- 3p與PMA誘導(dǎo)單核分化后的HL- 60細(xì)胞基因表達(dá)模式相似度為7%。
圖1研究路線與模型建立
Fig1Theoverallstrategyandestablishmentofcellmodels
HA represents HL- 60 cells induced by ATRA; HP represents HL- 60 cells induced by PMA; H29a and H142- 3p represents HL- 60 cells overexpressed miR- 29a and miR- 142- 3p mimic respectively
圖2過表達(dá)miR-29a/miR-142-3p與PMA/ATRA誘導(dǎo)髓系分化后基因表達(dá)模式相似性分析
Fig2ThesimilarityanalysisofgeneexpressionpatternbetweenHL-60cellsinducedbyPMA/ATRAandthecellsoverexpressedmiR-29a/miR-142-3p
2.3 GO與信號(hào)通路分析
GO與信號(hào)通路分析顯示,在ATRA誘導(dǎo)下上調(diào)且在miR- 142- 3p過表達(dá)組中同樣上調(diào)的基因,其中涉及白細(xì)胞激活這一生物學(xué)過程最為顯著(圖3)。在PMA誘導(dǎo)下上調(diào)且在miR- 142- 3p過表達(dá)組中同樣上調(diào)的基因,其中涉及糖胺聚糖的結(jié)合這一生物學(xué)過程最為顯著(圖3)。在ATRA誘導(dǎo)下下調(diào)且在miR- 142- 3p過表達(dá)組中同樣下調(diào)的基因,其中參與細(xì)胞組分形態(tài)發(fā)生的基因最為顯著(圖3)。在ATRA誘導(dǎo)下上調(diào)且在miR- 29a過表達(dá)組中同樣上調(diào)的基因,其中參與白細(xì)胞激活調(diào)控的生物學(xué)過程最為顯著(圖3)。在PMA誘導(dǎo)下上調(diào)且在miR- 29a過表達(dá)組中同樣上調(diào)的基因,其中涉及多糖連接的生物過程最為顯著(圖3)。在ATRA誘導(dǎo)下下調(diào)且在miR- 29a過表達(dá)組中同樣下調(diào)的基因,其中涉及血管發(fā)育這一生物學(xué)過程最為顯著(圖3)。在PMA誘導(dǎo)下下調(diào)且在miR- 29a過表達(dá)組中同樣下調(diào)的基因,其中參與磷酸鹽代謝過程的調(diào)節(jié)這一生物學(xué)過程最為顯著(圖3)。上述所涉及的所有基因,通過GeneMANIA對(duì)它們之間共表達(dá)、共定位、基因互作、通路、物理性互作進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)它們功能緊密相關(guān),以網(wǎng)絡(luò)形式共同行使相關(guān)功能(圖3)。
2.4 靶基因預(yù)測與雙熒光報(bào)告基因驗(yàn)證
靶基因預(yù)測結(jié)果如下:過表達(dá)miR- 29a組與ATRA誘導(dǎo)組表達(dá)變化相似,并與軟件預(yù)測結(jié)果疊加后,共預(yù)測76個(gè)miR- 29a的候選靶基因(圖4),其中12個(gè)基因?yàn)閙iR- 29a已報(bào)道的靶基因,且這些基因大部分集中在整個(gè)預(yù)測靶基因的排名中前列,說明了此預(yù)測方法的有效性;過表達(dá)miR- 29a組與PMA誘導(dǎo)組表達(dá)變化相似,并與軟件預(yù)測結(jié)果疊加后,共預(yù)測88個(gè)miR- 29a的候選靶基因(圖4),其中13個(gè)基因?yàn)閙iR- 29a已報(bào)道的靶基因,且這些基因同樣集中在整個(gè)預(yù)測靶基因排名的前部分。這兩部分預(yù)測的靶基因有大部分的重疊,根據(jù)這些靶基因的已知功能,篩選了9個(gè)與細(xì)胞分化、增殖或凋亡相關(guān)的候選基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 圖5A顯示了這9個(gè)靶基因3′UTR區(qū)miR- 29a的結(jié)合位點(diǎn)。通過報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明了miR- 29a的過表達(dá)能夠抑制包含ZBTB5、CaMKK2、SUV420H2、TRIB2和CANX3′UTR區(qū)的報(bào)告基因的表達(dá)(圖5)。
miRNAs是非編碼RNA中研究最為深入、作用機(jī)制相對(duì)明確的一大類調(diào)控分子,其功能廣泛,幾乎涉及生命活動(dòng)的各個(gè)方面[6- 8]。本實(shí)驗(yàn)室在此之前已對(duì)miR- 29a和miR- 142- 3p的功能與分子機(jī)制做過研究,本研究進(jìn)一步從整個(gè)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的角度闡述了miR- 29a和miR- 142- 3p促進(jìn)髓系分化的分子機(jī)制。
通過對(duì)上述數(shù)據(jù)的分析處理發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR- 29a/miR- 142- 3p所引起的基因表達(dá)模式變化與在PMA/ATRA誘導(dǎo)下向單核/粒細(xì)胞分化所引起的基因表達(dá)模式變化有一定的相似性。在miR- 29a/miR- 142- 3p過表達(dá)組中上調(diào)或下調(diào)的很多基因,在PMA/ATRA誘導(dǎo)組同樣上調(diào)或下調(diào)。說明miR- 29a/miR- 142- 3p可能通過調(diào)控這些與分化相關(guān)的基因的表達(dá)促進(jìn)HL- 60細(xì)胞向單核和粒細(xì)胞分化。進(jìn)一步的GO分析顯示,這些基因均參與一些能夠直接或間接影響髓系分化的生物學(xué)過程,例如激活白細(xì)胞、糖胺聚糖的連接[9]、細(xì)胞組分形態(tài)發(fā)生、調(diào)節(jié)磷酸鹽代謝[10]等過程,且它們能夠集成網(wǎng)絡(luò),共同參與同一生物學(xué)過程。這些結(jié)果說明miR- 29a/miR- 142- 3p通過這些與細(xì)胞分化相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)HL- 60細(xì)胞的髓系分化。本實(shí)驗(yàn)還鑒定了miR- 29a 5個(gè)新的靶基因,即ZBTB5、CaMKK2、SUV420H2、TRIB2和CANX。其中,ZBTB5為POK家族轉(zhuǎn)錄因子之一,有研究已證明其可通過抑制細(xì)胞周期阻滯基因P21的表達(dá)激活細(xì)胞增殖[11]。CaMKK2為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一,有研究表明CaMKK2可抑制髓系分化,阻礙粒系呈遞[12]。SUV420H2編碼組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,其可作為一個(gè)甲基化“開關(guān)”促進(jìn)成肌分化[13]。TRIB2為Tribbles家族3成員之一,已有報(bào)道稱Tribbles家族成員可共同促進(jìn)C/EBPalpha的降解,而后者為一種轉(zhuǎn)錄因子,突變后可誘發(fā)急性髓系白血病[14]。CANX為鈣聯(lián)接蛋白,可參與抑制細(xì)胞凋亡[15]。因此,miR- 29a除已知報(bào)道的靶基因之外,還可能通過上述5個(gè)與髓系分化相關(guān)的靶基因參與調(diào)控髓系分化過程。但這5個(gè)靶基因與miR- 29a之間的關(guān)系以及這5個(gè)靶基因在髓系分化過程中的功能還需要進(jìn)一步研究。
HA:ATRAinduced; HP:PMA-induced; H29a:overexpressed miR-29a; H142-3P:overexpressed miR-142-3P
A.HAvsH29a; B.HPvsH29a; C.HAvsH142-3P; D.HPvsH142-3P; HA:ATRA-induced; HP:PMA-induced; H29a:overexpressed miR-29a; H142-3P:overexpressed miR-142-3P
圖4靶基因預(yù)測統(tǒng)計(jì)結(jié)果
Fig4Statisticalresultoftargetgenesprediction
圖5miR-29a靶基因驗(yàn)證
Fig5TheverificationofmiR-29atargetgenes
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)miR- 29a/miR- 142- 3p過表達(dá)可引發(fā)整個(gè)基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的改變,使之趨向于髓系分化過程中的基因表達(dá)變化,從而促進(jìn)髓系分化進(jìn)程。這些結(jié)果有助于深入理解髓系分化過程的本質(zhì)以及miR- 29a/miR- 142- 3p參與促進(jìn)髓系分化的分子機(jī)制。
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The regulatory network in myeloid differentiation promoted by miR- 29a and miR- 142- 3p
DONG He, MA Yan-ni, DONG Lei, ZHAO Hua-lu, ZHANG Jun-wu, WANG Fang, YU Jia*
(Dept. of Biochemistry, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS,School of Basic Medicine, PUMC, State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Beijing 100005, China)
ObjectiveTo find the regulatory network of myeloid differentiation promoted by miR- 29a/miR- 142- 3p deeply.MethodsFirstly, miR- 29a and miR- 142- 3p were overexpressed in HL-60 cells meanwhile HL- 60 cells were also induced towards monocyte and granulocyte differentiation using PMA and ATRA respectively. To observe the nuclear morphometry change and utilize real time PCR to detect the expression ofCD11 andCD14 in cells. Genes which possessed similar expression pattern were obtained by microarray and analyzed for their similarities. Analyzed by GO and signal pathway clustering using DAVID and GeneMANIA. Utilizing PicTar and TargetScan, predicted new targets of miR- 29a which were also verified by double-luciferase reporter assay.ResultsMany differential expressed genes during ATRA/PMA induced myeloid differentiation or in the cells with miR- 29a/miR- 142- 3p overexpression were similar. Significantly enriched genes in GO analysis which also possessed similar expression patterns were almost associated with cell differentiation.ConclusionsmiR- 29a and miR- 142-3p regulate the activity of their targets, triggered global gene expression change so as to make it closer to that during myeloid differentiation and then promoted myeloid differentiation.ZBTB5,CaMKK2,SUV420H2,TRIB2 andCANXmay play an important roles in myeloid differentiation promoted by miR- 29a.
miR- 29a; miR- 142- 3p; myeloid differentiation; gene expression; GO analysis
2014- 02- 28
2014- 04- 23
科技部重大科學(xué)問題導(dǎo)向項(xiàng)目(2011043)
*通信作者(correspondingauthor):j-yu@ibms.pumc.edu.cn
1001-6325(2014)07-0896-08
研究論文
Q 254
A