司方瑩，李朵璐，闞全程

(鄭州大學 第一附屬醫(yī)院 藥劑科， 河南 鄭州 450052)

STAT3信號通路與乳腺癌紫杉醇耐藥相關

司方瑩，李朵璐，闞全程*

(鄭州大學 第一附屬醫(yī)院 藥劑科， 河南 鄭州 450052)

信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)是一種存在于胞質(zhì)的雙功能蛋白，其在腫瘤的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化中起關鍵作用[1]。目前研究表明：STAT3信號通路可能與腫瘤細胞化療耐藥相關。本研究探討STAT3信號通路與乳腺癌紫杉醇耐藥相關，以期將分子治療與傳統(tǒng)化療有效結(jié)合。

1 材料與方法

1.1 材料:紫杉醇(雙鷺藥業(yè)有限公司)；STAT3及pSTAT3第一抗體、IRDye 680LT標記的山羊抗兔IgG、鼠抗人Actin一抗和IRDye 800CW標記的山羊抗鼠IgG(本實驗室保存)；STAT3-siRNA正義鏈：5′-GGUACAUCAUGGGCUUUAUTT-3′，反義鏈：5′-AUAAAGCCCAUGAUGUACCTT-3′；無義對照siRNA正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-AC GUGACACGUUCGGAGAATT-3′，上海吉瑪制藥有限公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng):人紫杉醇敏感和耐藥乳腺癌細胞系：Mcf-7和Mcf-7/TR(本實驗室保存)。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，37 ℃，飽和濕度、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染:將Mcf-7/TR細胞接種于6孔板，細胞匯合度為60%～80%時進行siRNA轉(zhuǎn)染，將細胞分為3組：空白對照組,非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組,STAT3-siRNA轉(zhuǎn)染組。按照Lipofectamine RNAiMAX操作說明書進行細胞轉(zhuǎn)染，siRNA終濃度為30 nmol/L，轉(zhuǎn)染后72 h收獲細胞。每組設2個復孔，重復3次實驗。

1.4 MTT法檢測細胞的增殖活性:取對數(shù)增殖期細胞，5 000個/孔接種于96孔板，分為Mcf-7組、Mcf-7/TR組、STAT3-siRNA轉(zhuǎn)染的Mcf-7組及STAT3-siRNA轉(zhuǎn)染的Mcf-7/TR組,共4組，100 μL/孔，過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，每孔加入0.001、0.01、0.05、0.25 μmol/L的紫杉醇，72 h后，加入MTT 20 μL(5 g/L)，孵育4 h，加入DMSO，200 μL/孔，振蕩10 min，酶標儀在570 nm檢測波長下測定A值。細胞抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。計算半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾后STAT3蛋白表達水平：與對照組相比，STAT3-siRNA顯著下調(diào)耐藥細胞中STAT3及pSTAT3蛋白表達水平(Plt;0.05)(圖1，表1)。

1.normal；2.negative；3.STAT3-siRNA圖1 STAT3蛋白表達水平Fig 1 STAT3 protein expression

表1 STAT3-siRNA轉(zhuǎn)染紫杉醇耐藥乳腺癌細胞后STAT3及pSTAT3蛋白相對表達量Table 1 Relative expression of STAT3 and pSTAT3protein in Mcf-7/TR treated by STAT3-siRNA

*Plt;0.05, compared with normal group.

表2 紫杉醇對不同處理組細胞抑制率Table 2 Inhibition ratio of different cell lines treated by Taxol(±s,%)

*Plt;0.05 compared with Mcf-7/TR.

2.2 STAT3-siRNA對Mcf-7/TR的反轉(zhuǎn)耐藥作用:STAT3-siRNA轉(zhuǎn)染Mcf-7/TR后，紫杉醇對其抑制率明顯增高(Plt;0.05)(表2)，同時，Mcf-7/TR在轉(zhuǎn)染后對紫杉醇的IC50降低(Plt;0.05)(圖2)。

*Plt;0.05 compared with control group圖2 不同處理組細胞對紫杉醇的IC50Fig 2 IC50 to Taxol of different cell lines

3 討論

大量研究表明，阻斷STAT3信號通路能抑制腫瘤細胞的生長，并增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[2- 3]。然而，STAT3在乳腺癌耐藥中的作用目前尚未見報道。本研究利用RNA干擾技術(shù)阻斷STAT3信號通路，觀察沉默STAT3后紫杉醇對乳腺癌紫杉醇耐藥細胞增殖活性及耐藥性的影響。

Western blot實驗結(jié)果顯示，STAT3、pSTAT3在Mcf-7/TR細胞中高表達，且轉(zhuǎn)染STAT3特異性siRNA后STAT3、pSTAT3蛋白表達明顯下降。MTT結(jié)果顯示，紫杉醇對STAT3-siRNA轉(zhuǎn)染的Mcf-7/TR細胞抑制率明顯增高，STAT3-siRNA增強紫杉醇對耐藥細胞的抑制作用，并反轉(zhuǎn)乳腺癌紫杉醇耐藥細胞的化療耐藥。

綜上所述，本研究為以STAT3為靶點的腫瘤基因治療與傳統(tǒng)化療結(jié)合，及促進STAT3通路抑制劑，如COOD-Me，在逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥方面的臨床應用提供實驗依據(jù)，對于腫瘤的治療具有重要意義。

[1] Benjamin B, Arnaud V, Neil P,etal. The STAT3 oncogene as a predictive marker of drug resistance[J]. Trend Mol Med,2007,13:4- 11.

[2] Kohsaka S,Wang L,Yachi K,etal. STAT3 inhibition overcomes temozolomide resistance in glioblastoma by downregulating MGMT expression[J]. Mol Cancer Ther,2012,11: 1289- 1299.

[3] Huang S,Chen M,Shen Y,etal. Inhibition of activated Stat3 reverses drug resistance to chemotherapeutic agents in gastric cancer cells [J].Cancer Lett, 2012, 315:198- 205.

2014- 04- 10

2014- 05- 16

*通信作者(correspondingauthor)：johnyuem@zzu.edu.cn

1001-6325(2014)07-0996-02

R 737.9

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