南雪 ，曾泉，呂洋，姚海雷，陳琳，岳文，裴雪濤

軍事醫(yī)學科學院 a.野戰(zhàn)輸血研究所 全軍干細胞與再生醫(yī)學重點實驗室，北京 100850；b.華南干細胞與再生醫(yī)學研究中心，廣東 廣州 510005

原發(fā)性肝癌是世界范圍內發(fā)病率高、惡性高、預后差的惡性腫瘤之一，它的發(fā)病是多因素導致的復雜過程[1-2]。對于肝癌發(fā)生、復發(fā)與轉移分子機制的探討，依然是目前腫瘤分子生物學研究領域最為重要的問題之一。與其他惡性腫瘤一樣，肝癌的發(fā)生與發(fā)展是包括原癌基因激活或/和抑癌基因失活的多階段多步驟過程[3-4]。在此過程中，基因突變、染色體擴增等基因遺傳學的改變無疑發(fā)揮著極其重要的作用。此外，表觀遺傳學的改變，尤其是microRNA（miRNA）表達改變造成的原癌基因的失活或抑癌基因的沉默也同樣發(fā)揮著重要作用[5-6]。miRNA 是近年發(fā)現(xiàn)的一類長度僅為18～25 個核苷酸的內源性非編碼小RNA，成熟miRNA 的5'非翻譯區(qū)的2～7 個核苷酸的“種子序列”可以與靶mRNA 的3'非翻譯區(qū)互補結合，在轉錄后水平上抑制靶基因的表達[7-8]。miRNA 在細胞生長、增殖、發(fā)育和凋亡過程中發(fā)揮重要作用，并與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關。miRNA在腫瘤中發(fā)揮著相當于癌基因或抑癌基因的作用，調節(jié)著腫瘤細胞的多種重要的生物學行為[5-8]。近年來，miRNA 調控腫瘤增殖和轉移的研究成為熱點，包括miRNA-125b等在內的許多miRNA被證明在肝癌的發(fā)生與轉移中發(fā)揮重要作用[9-10]。

我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的基質細胞可以促進腫瘤細胞中miR-155 的表達，但miR-155 對肝癌細胞發(fā)揮怎樣的影響有待明確[11]。在以上工作基礎上，我們在Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細胞系中過表達miR-155，發(fā)現(xiàn)miR-155 的表達明顯促進腫瘤細胞的生長。

1 材料與方法

1.1 材料

Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細胞由本室保存；真核表達載體pcDNA3.0-miR-155 由軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所鄭曉飛教授饋贈；限制性內切酶、核酸分子量標記等購自寶生物公司；反轉錄試劑盒及實時定量用SYBR Green 染料購自Qiagen 公司；CCK8購自同仁株式會社；高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone 公司；LipofectAMINE 2000 及TRIzol 購自Invitrogen 公司；引物合成由上海英駿公司完成。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉染

將Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細胞接種于6 孔板中，用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；用LipofectAMINE 2000 轉染細胞，每孔加入溶解于opti-MEM 的10μL LipofectAMINE 2000和4μg pcDNA3.0-miR-155 質粒DNA，對照組加入與實驗組等量的LipofectAMINE 2000和pcDNA3.0 質粒DNA；轉染第2 d 換液，72 h后收獲細胞，用于miRNA的實時定量PCR檢測。

1.3 實時定量PCR 檢測miR-155 在細胞中的表達水平

轉染pcDNA3.0-miR-155 質粒及pcDNA3.0 質粒72 h后，用TRIzol提取Huh7.5.1及Hcclm3細胞的總RNA，經(jīng)酚氯仿抽提純化RNA，用反轉錄試劑盒對總RNA 進行反轉錄得到cDNA，采用SYBR Green法實時定量PCR 檢測。上游引物為5'-TTAATGCT AATCGTGATAGGGGT-3'，下游引物為5'-GATTGA ATCGAGCACCAGTTAC-3'；PCR 條 件：95℃ 15 min；95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)。以U6 基因為內參，上游引物為5'-CGCTTCGGCAG CACATATACTA-3'，下游引物為5'-GATTGAATCG AGCACCAGTTAC-3'；PCR 條件：95℃15 min；95℃15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)。各組PCR均進行3復孔重復。

1.4 CCK8法及克隆形成實驗檢測細胞增殖

1.4.1 CCK8 法檢測 將轉染24 h 后的細胞以每孔2×103/100μL 的密度接種于96 孔板，培養(yǎng)24、72和120 h 后分別進行CCK8 檢測。加入10μL CCK8，繼續(xù)在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 h，檢測D450nm值，每組均進行6復孔重復。

1.4.2 克隆形成實驗 轉染后將細胞以2×103/孔的密度接種于6 孔板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3 d 換液，2 周后棄去培養(yǎng)液，用PBS 洗3 次，加入0.1%結晶紫溶液（含10%福爾馬林）固定20 min，用自來水柔和沖洗，自然干燥，照相保存。

1.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以x±s表示；應用t檢驗進行兩均數(shù)間的差異性分析。

2 結果

2.1 pcDNA3.0-miR-155真核表達載體的鑒定

用限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ對pcDNA3.0-miR-155 質粒進行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在350 bp 及5.4 kb 左右出現(xiàn)條帶，符合預期結果（圖1），測序結果與GenBank中序列一致。

2.2 miR-155 在Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細胞系中的表達

將Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細胞培養(yǎng)至密度80%左右（圖2），轉染pcDNA3.0-miR-155 質粒，72 h后對細胞進行實時定量PCR，檢測miR-155的表達情況，以轉染pcDNA3.0質粒為陰性對照。結果顯示陽性組表達水平比陰性組分別高約431 倍及16 倍（P＜0.01）（圖3），說明pcDNA3.0-miR-155 質粒能有效地高表達成熟的miR-155。

2.3 miR-125b高表達對細胞增殖的影響

圖1 pcDNA3.0-miR-155質粒的HindⅢ/XhoⅠ雙酶切鑒定

圖2 Hcclm3（A）和Huh7.5.1（B）肝癌細胞

CCK8 法檢測結果表明，與轉染pcDNA3.0 陰性對照載體組相比，pcDNA3.0-miR-155 質粒轉染Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細胞72 h 后細胞增殖受到明顯促進，二者差異非常顯著（P＜0.01）（圖4）?？寺⌒纬蓪嶒炇菍渭毎麘乙阂暂^低的細胞密度接種于培養(yǎng)孔板中，經(jīng)相對較長時間的培養(yǎng)來考察單個細胞的增殖能力，實驗結果也說明miR-155 促進了肝癌細胞的增殖（圖5）。

3 討論

肝癌是嚴重威脅人類健康的疾病，其發(fā)生是多步驟多因素過程。與其他惡性腫瘤一樣，肝癌依然存在不能早期診斷及預后差等問題。因此，對其發(fā)生的分子機理研究依然非常重要。越來越多的研究表明，包括miRNA 在內的表觀遺傳學調控機制在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色[4，12-14]。

圖3 實時定量PCR檢測轉染72 h后Huh7.5.1及Hcclm3肝癌細胞中miR-155的表達

圖4 CCK8法檢測Huh7.5.1及Hcclm3肝癌細胞的增殖

圖5 克隆形成實驗證明miR-155促進Huh7.5.1及Hcclm3肝癌細胞的增殖

1993 年，Lee 等在線蟲中發(fā)現(xiàn)了首個miRNA；之后Calin 等首次在人的慢性淋巴細胞白血病中發(fā)現(xiàn)miR-15a及miR-16-1表達異常；此后越來越多的研究證明miRNA 與腫瘤的增殖、分化及凋亡等相關，并且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-16]。最新的證據(jù)表明，多種miRNA 在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)生明顯變化，包括let-7、miR-29和miR-122 等在內的miRNA 下調，而miR-21、miR-221、miR-51和miR-517a等多種miRNA顯著上調[17-20]。探討這些表達變化的miRNA 對肝癌細胞生物學行為的影響，并研究其臨床轉化意義，將有助于理解肝癌發(fā)生發(fā)展的機理，進一步為腫瘤診斷與治療靶標的發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。

在前期工作中，我們系統(tǒng)研究了肝腫瘤微環(huán)境的變化，并探討這些變化對于肝癌細胞生物學活性的影響[11]。研究發(fā)現(xiàn)，微環(huán)境中的基質細胞呈激活狀態(tài)，其表達和分泌的活性因子發(fā)生顯著性變化，包括S100A4、MMP1、S100A11、HGF、FGF13、FGF5、CCL13、IL-24、S100A3、CXCL12、Gremlin2和WNT2等（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE42357)，而這些因子的變化無疑將進一步影響腫瘤細胞的生物學活性。我們進一步篩選包括S100A4 等在內的因素對腫瘤細胞的影響，尤其關注腫瘤細胞內miRNA 的變化，發(fā)現(xiàn)miR-155 的表達發(fā)生了明顯上調。那么，進一步明確miR-155 對肝癌細胞的生物學活性，尤其是對腫瘤細胞增殖活性的影響，將有助于進一步了解腫瘤微環(huán)境的分子調控機制，具有重要的生物學意義。

綜上，本研究通過外源性過表達的分子生物學手段探討了miR-155 對肝癌細胞增殖能力的影響，結果初步證明了miR-155 促進腫瘤細胞的增殖活性，對于進一步揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的病理機制，尤其是了解腫瘤微環(huán)境在肝癌發(fā)生中的作用具有重要意義。在未來的工作中，我們將進一步探索miR-155的作用機制，明確其發(fā)揮增殖調控作用的靶基因與分子信號通路，研究結果將促進肝癌發(fā)生機制及新的腫瘤診療靶點的發(fā)現(xiàn)。

[1]蔡永娥,喬建錦,孫曉茹,等.我國原發(fā)性肝癌研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2008,16(1):141-143.

[2]孫勁松,陳桂明,龍志雄,等.待原發(fā)性肝癌綜合治療進展[J].中國腫瘤臨床與康復,2005,12(5):468-470.

[3]于秀石,關媛媛,田菊霞.肝癌發(fā)生的相關分子機制研究進展[J].健康研究,2010,30(5):390-393.

[4]鄧敬桓,秦雪.原發(fā)性肝癌發(fā)生機制的研究進展[J].環(huán)境與健康雜志,2007,24(11):924-926.

[5]周凡,莊詩美.microRNA與腫瘤[J].生命科學,2008,20(2):207-212.

[6]王建軍,王澤友.miRNA 與腫瘤的研究進展[J].腫瘤藥學,2011,1(3):169-172.

[7]Calin G A,Croce C M.microRNA signatures in human cancers[J].Nat Rev Cancer,2006,6(11):857-866.

[8]Bartel D P.microRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[9]Jiang J X,Gao S,Pan Y Z,et al.Overexpression of miRNA-125b sensitizes human hepatocellular carcinoma cells to 5-fluorouracil through inhibition of glycolysis by targeting hexokinaseⅡ[J].Mol Med Rep,2014,10(2):995-1002.

[10]Liang L,Wong C M,Ying Q,et al.microRNA-125b suppressesed human liver cancer cell proliferation and metastasis by directly targeting oncogene LIN28B2[J].Hepatology,2010,52(5):1731-1740.

[11]Xiong Y,Fang J H,Yun J P,et al.Effects of microRNA-29 on apoptosis,tumorigenicity,and prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2010,51(3):836-845.

[12]朱貴忠,聶明.miRNA 在肝癌中的研究進展[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2011,38(20):4246-4247.

[13]陳彪.miRNA 在原發(fā)性肝癌中的研究進展[J].臨床腫瘤學雜志,2012,17(10):946-950.

[14]徐娜,原紅霞,林娟,等.miRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展機制中的研究進展[J].中國醫(yī)藥指南,2012,10(22):81-82.

[15]Lee R C,Feinbaum R L,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[16]Calin G A,Cimmino A,Fabbri M,et al.miR-15a and miR-16-1 cluster functions in human leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(13):5166-5171.

[17]Xiong Y,Fang J H,Yun J P,et al.Effects of microRNA-29 on apoptosis,tumorigenicity,and prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2010,51(3):836-845.

[18]Parpart S,Roessler S,Dong F,et al.Modulation of miR-29 expression by alpha-fetoprotein is linked to the hepatocellular carcinoma epigenome[J].Hepatology,2014,60(3):872-883.

[19]Liu R F,Xu X,Huang J,et al.Down-regulation of miR-517a and miR-517c promotes proliferation of hepatocellular carcinoma cells via targeting Pyk2[J].Cancer Lett,2013,329(2):164-173.

[20]Toffanin S,Hoshida Y,Lachenmayer A,et al.microRNAbased classification of hepatocellular carcinoma and oncogenic role of miR-517a[J].Gastroenterology,2011,140(5):1618-1628.