朱軍保，王丹，汪文倫，許萬云，高劍峰

石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000

微藻是地球上最早出現(xiàn)的生命類群，是一類可利用光合作用的低等植物，一般為單細(xì)胞結(jié)構(gòu)，呈群體或絲狀，種類繁多，分布極其廣泛，在海洋、淡水湖泊、樹干、潮濕的土壤、干燥的沙漠，只要有光和潮濕的地方都有藻類的身影[1-3]。沙漠中藻類的分布也極其廣泛，其中大多數(shù)為綠藻和藍(lán)藻。沙漠小球藻就是生長在沙漠中的綠藻。這些藻類生長在干旱半干旱區(qū)，地面完全被沙所覆蓋，植物稀少，雨水缺乏，空氣干燥，環(huán)境極其惡劣[4]?？梢哉f，沙漠小球藻是綠藻門中具有極強(qiáng)生命力的一類微藻。

小球藻是比較經(jīng)濟(jì)型的綠色單細(xì)胞植物，細(xì)胞形態(tài)為橢圓形或圓形，直徑為2～12 μm，細(xì)胞壁一般較薄，少數(shù)堅(jiān)固，有時(shí)會(huì)分泌黏質(zhì)使其多個(gè)細(xì)胞黏在一起，人們用肉眼很難看到，需要借助顯微鏡進(jìn)行辨別[5]。小球藻由于其生態(tài)分布廣，繁殖速度快，培養(yǎng)簡便，廉價(jià)等特點(diǎn)，是用于生物技術(shù)及生物質(zhì)能源研究的理想材料，而利用基因工程技術(shù)研究小球藻是微藻生物技術(shù)的一個(gè)重要分支。在小球藻基因工程中，最為重要的環(huán)節(jié)是選擇合適的選擇標(biāo)記基因。迄今在小球藻基因工程中確定選擇標(biāo)記基因的最常用方法有2 種，一種方法是抗生素篩選法，另一種是代謝突變補(bǔ)償方法[6]。將抗性基因和目的基因同時(shí)轉(zhuǎn)入被轉(zhuǎn)化的藻細(xì)胞中，并且在含有抗性的培養(yǎng)基中篩選出陽性克隆，即為抗生素法選擇標(biāo)記基因。

我們運(yùn)用微藻在液體培養(yǎng)過程中藻液顏色變化、血球板細(xì)胞計(jì)數(shù)和藻細(xì)胞固體平板培養(yǎng)的方法，系統(tǒng)性研究了4 株沙漠小球藻對(duì)幾種基因工程中常用抗生素的敏感性，以期為今后的沙漠小球藻基因工程研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

4 株沙漠小球藻均由本實(shí)驗(yàn)室從新疆沙漠沙樣中分離鑒定，其中GTD8A1、GTD4A-1 和GTD7C-2分離自古爾班通古特沙漠，TLD6B 分離自塔克拉瑪干沙漠[7-8]。

5 種抗生素均購自北京索萊寶科技有限公司，抗生素母液的配制參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[9]。各抗生素儲(chǔ)存液質(zhì)量濃度為：氨芐西林（Ap）100 mg/mL，頭孢霉素（Cef）50 mg/mL，卡那霉素（Km）50 mg/mL，氯霉素（Cm）50 mg/mL，鏈霉素（St）50 mg/mL。其中氯霉素用無水乙醇配制成母液，其他抗生素溶液均用無菌蒸餾水配制；采用0.22 μm 濾膜過濾除菌，貯存于-20℃冰箱中。

藻種所用的BBM 培養(yǎng)基[10]：NaNO3250 mg/L，KH2PO4175 mg/L，K2HPO475 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，CaCl2·2H2O 25 mg/L，NaCl 25 mg/L，EDTA 50 mg/L，KOH 31 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 4.98 mg/L，H3PO411.42 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L，MnCl21.44 mg/L，MnO30.71 mg/L，CaSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co（NO3）2·6H2O 0.49 mg/L，98% H2SO42 μL/L（可在以上組分中加入15～20 g 瓊脂，加入蒸餾水補(bǔ)至1 L 制成固體培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，4℃保存）。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L（加去離子水溶解至終體積1 L，用1 mol/L NaOH 調(diào)pH 值為7.0～7.4，同時(shí)加入15～20 g瓊脂粉，制成固體培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min）。

1.2 藻細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)

將分離純化的4 株沙漠小球藻按相同濃度接種于含有BBM 培養(yǎng)基的三角瓶中，在光照度為2500 lx、光暗周期12 h/12 h、溫度為23℃的條件下在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，15～20 d為1個(gè)周期。

1.3 4株沙漠小球藻對(duì)5種抗生素的敏感性測(cè)定

分別取經(jīng)活化后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的藻種GTD8A1、GTD4A-1、GTD7C-2 和TLD6B（相同濃度）0.5 mL 加入六孔板中，再加入相應(yīng)的不同濃度的抗生素（表1）及5 mL BBM 液體培養(yǎng)基，抗生素濃度由多次預(yù)試驗(yàn)確定，每個(gè)濃度設(shè)立2 個(gè)平行觀察培養(yǎng)，并設(shè)置對(duì)照組（不添加任何抗生素）同時(shí)比對(duì)各藻液顏色變化，每24 h用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)1次，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d。

血球計(jì)數(shù)板測(cè)定方法：每次取50 μL藻液，用碘液（稱取13 g 碘及35 g 碘化鉀，溶于100 mL 水中，稀釋定容至1000 mL，搖勻，貯存于棕色瓶中）固定，用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下測(cè)定藻細(xì)胞密度[11]。

2 結(jié)果

2.1 不同抗生素對(duì)沙漠小球藻生長狀況的影響

2.1.1 對(duì)GTD8A1 生長狀況的影響 圖1 是GTD8A1 經(jīng)不同抗生素不同濃度梯度處理后培養(yǎng)至第7 d 時(shí)與未加抗生素的藻液培養(yǎng)至第7 d 時(shí)的藻細(xì)胞數(shù)差值，柱圖在橫軸上方表明抗生素促進(jìn)了藻細(xì)胞的生長，反之則抑制了藻細(xì)胞的生長。由圖可知，氨芐西林在一定的濃度梯度內(nèi)具有促進(jìn)GTD8A1 生長的作用，且在100～800 μg/mL 濃度內(nèi)，隨著氨芐西林濃度的升高，其促進(jìn)生長的作用越來越明顯。頭孢霉素相對(duì)于氨芐西林促進(jìn)GTD8A1 生長的作用更為強(qiáng)烈，濃度為400 μg/mL 時(shí)對(duì)GTD8A1 生長的促進(jìn)作用最為明顯，7 d 時(shí)的細(xì)胞密度為空白對(duì)照組的2 倍。鏡檢氨芐西林和頭孢霉素在以上濃度范圍內(nèi)的藻液，發(fā)現(xiàn)二細(xì)胞較多，可見在一定濃度范圍內(nèi)氨芐西林和頭孢霉素促進(jìn)了GTD8A1 的分裂繁殖，而當(dāng)氨芐西林濃度達(dá)到1000 μg/mL、頭孢霉素濃度達(dá)到800 μg/mL 時(shí)，二者對(duì)藻細(xì)胞的生長才有明顯的抑制作用。而卡那霉素、氯霉素和鏈霉素在所設(shè)濃度梯度范圍內(nèi)對(duì)GTD8A1 的生長都有較為明顯的抑制作用，在所設(shè)最低濃度25 μg/mL 時(shí)就已經(jīng)表現(xiàn)出了對(duì)藻細(xì)胞生長的抑制作用，且隨著抗生素濃度的增加，對(duì)GTD8A1 生長的抑制作用越來越明顯，沒有促進(jìn)藻細(xì)胞的生長。比較這3種抗生素對(duì)GTD8A1生長的抑制作用，可發(fā)現(xiàn)氯霉素的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于鏈霉素，卡那霉素的抑制作用則介于氯霉素與鏈霉素之間。因此，高濃度的頭孢霉素適用于實(shí)驗(yàn)室大規(guī)?；囵B(yǎng)GTD8A1；做基礎(chǔ)無菌培養(yǎng)時(shí)，可選擇對(duì)GTD8A1 生長影響最小的低濃度氨芐西林作為抑菌劑；而鏈霉素和卡那霉素可作為GTD8A1 藻細(xì)胞基因工程遺傳轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記。

表1 5種抗生素的濃度梯度（μg/mL）

圖1 5種抗生素不同濃度梯度與未加抗生素作用下培養(yǎng)至第7 d時(shí)GTD8A1的細(xì)胞計(jì)數(shù)差值

2.1.2 對(duì)GTD4A-1 生長狀況的影響 圖2 是GTD4A-1 經(jīng)不同抗生素不同濃度梯度處理后培養(yǎng)至第7 d 時(shí)與未加抗生素的藻液培養(yǎng)至第7 d 時(shí)的藻細(xì)胞數(shù)差值。由圖可知，氨芐西林在一定的濃度梯度內(nèi)具有促進(jìn)GTD4A-1 生長的作用，且在100～800 μg/mL 濃度梯度內(nèi)，隨著氨芐西林濃度的升高，其促進(jìn)生長的作用越來越明顯，在7 d 時(shí)，氨芐西林濃度為800 μg/mL 的藻細(xì)胞密度約為未加氨芐西林細(xì)胞密度的1.5 倍，而低濃度的氨芐西林（如濃度為100 μg/mL）對(duì)GTD4A-1 的生長影響不大，高濃度（1000 μg/mL）的氨芐西林抑制GTD4A-1 的生長。低濃度的頭孢霉素對(duì)GTD4A-1 具有較強(qiáng)的生長促進(jìn)作用，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著頭孢霉素濃度的升高，這種促進(jìn)作用逐漸降低，濃度為800 μg/mL 時(shí)抑制GTD4A-1 生長的作用最為明顯；濃度為50 μg/mL 時(shí)促進(jìn)GTD4A-1生長的作用最為明顯，7 d時(shí)細(xì)胞密度為空白對(duì)照的3 倍多。低濃度的氯霉素對(duì)GTD4A-1 的影響不大，具有一定的抑菌性，高濃度的氯霉素對(duì)GTD4A-1 的生長具有較強(qiáng)的抑制作用。鏈霉素、卡那霉素對(duì)GTD4A-1的生長具有明顯的抑制作用，在所設(shè)最低濃度25 μg/mL 時(shí)對(duì)GTD4A-1 的生長就表現(xiàn)出抑制作用，且隨著濃度的增加，對(duì)GTD4A-1 的抑制作用越來越明顯。因此，在制備無菌藻液時(shí)可選用適當(dāng)濃度的氨芐西林、頭孢霉素或氯霉素作為抑菌劑，而卡那霉素和鏈霉素可作為GTD4A-1 藻細(xì)胞基因工程遺傳轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記。

圖2 5種抗生素不同濃度梯度與未加抗生素作用下培養(yǎng)至第7 d時(shí)GTD4A-1的細(xì)胞計(jì)數(shù)差值

2.1.3 對(duì)GTD7C-2 生長狀況的影響 圖3 是GTD7C-2 經(jīng)不同抗生素不同濃度梯度處理后培養(yǎng)至第7 d 時(shí)與未加抗生素的藻液培養(yǎng)至第7 d 時(shí)的藻細(xì)胞數(shù)差值。由圖可知，5 種抗生素在所設(shè)的梯度范圍內(nèi)對(duì)GTD7C-2 的生長均具有不同程度的抑制作用。低濃度的氨芐西林對(duì)GTD7C-2 生長的抑制作用不太顯著，高濃度則抑制GTD7C-2 的生長，總體來講，隨著氨芐西林濃度的增加，其對(duì)藻細(xì)胞生長的抑制作用越來越強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到最大1000 μg/mL 時(shí)，對(duì)GTD7C-2 生長的抑制作用最強(qiáng)。低濃度的頭孢霉素對(duì)GTD7C-2 的生長影響不大，在所設(shè)的最高濃度800 μg/mL 時(shí)對(duì)GTD7C-2 的生長才有強(qiáng)烈的抑制作用?？敲顾亍⒙让顾睾玩溍顾貙?duì)GTD7C-2 的生長抑制作用較為明顯，在所設(shè)最低濃度25 μg/mL 時(shí)就表現(xiàn)出很強(qiáng)的敏感性，不過在所設(shè)濃度梯度內(nèi)對(duì)GTD7C-2 生長的這種抑制作用沒有太大變化。因此，在制備無菌藻液時(shí)可選用適當(dāng)濃度的氨芐西林和頭孢霉素作為抑菌劑，而卡那霉素、氯霉素和鏈霉素可作為GTD7C-2 藻細(xì)胞基因工程遺傳轉(zhuǎn)化中的選擇標(biāo)記。

圖3 5種抗生素不同濃度梯度與未加抗生素作用下培養(yǎng)至第7 d時(shí)GTD7C-2的細(xì)胞計(jì)數(shù)差值

2.1.4 對(duì)TLD6B生長狀況的影響 圖4是TLD6B經(jīng)不同抗生素不同濃度梯度處理后培養(yǎng)至第7 d 時(shí)與未加抗生素的藻液培養(yǎng)至第7 d 時(shí)的藻細(xì)胞數(shù)差值。由圖可知，TLD6B 對(duì)低濃度的氨芐西林與頭孢霉素的敏感性不大，氨芐西林濃度為200 μg/mL、頭孢霉素濃度為50 μg/mL時(shí)，對(duì)TLD6B的生長基本沒有表現(xiàn)出抑制作用；當(dāng)氨芐西林濃度為400 μg/mL、頭孢霉素濃度為100 μg/mL 以上時(shí)，對(duì)TLD6B 的生長才表現(xiàn)出較為明顯的抑制作用，且隨著抗生素濃度的增加，其抑制作用越來越強(qiáng)。TLD6B對(duì)鏈霉素、卡那霉素、氯霉素都較為敏感，這3 種抗生素在所設(shè)最低濃度25 μg/mL 時(shí)對(duì)TLD6B 的生長就有非常明顯的抑制作用，且隨著抗生素濃度的增加，抑制作用越來越明顯，其抑制作用強(qiáng)度依次為鏈霉素＞卡那霉素＞氯霉素。因此，可在TLD6B 的培養(yǎng)液中加入低濃度的氨芐西林或頭孢霉素作為抑菌劑，這樣不僅可以避免污染，還對(duì)TLD6B 細(xì)胞的生長具有促進(jìn)作用，適于實(shí)驗(yàn)室的規(guī)?；囵B(yǎng)和無菌藻液的制備；而鏈霉素、卡那霉素則可作為TLD6B 藻細(xì)胞基因工程遺傳轉(zhuǎn)化中的選擇標(biāo)記。

2.2 不同抗生素作用下沙漠小球藻培養(yǎng)液顏色的變化

依據(jù)前述方法，用抗生素處理各藻種，定期觀察六孔板中各藻液顏色的變化，培養(yǎng)7 d 時(shí)的各藻液顏色結(jié)果見表2。

2.3 沙漠小球藻對(duì)不同抗生素的敏感性測(cè)定結(jié)果

圖4 5種抗生素不同濃度梯度與未加抗生素作用下培養(yǎng)至第7 d時(shí)TLD6B的細(xì)胞計(jì)數(shù)差值

綜合各抗生素對(duì)4 株沙漠小球藻生長狀況的影響及其培養(yǎng)到7 d時(shí)培養(yǎng)液顏色的變化，將4株沙漠小球藻對(duì)各抗生素的敏感性總結(jié)于表3，當(dāng)各抗生素的濃度達(dá)到表中數(shù)值時(shí)，都對(duì)各藻株的生長具有明顯的抑制作用，表現(xiàn)為非常敏感。

3 討論

從國外研究進(jìn)展來看，迄今選擇標(biāo)記小球藻基因工程中常用的是G418（氨基糖苷類抗生素）[12-13]和潮霉素[14-16]，但不同種類的小球藻對(duì)抗生素的敏感性不一，以上研究結(jié)果也有差別。從國內(nèi)進(jìn)展看，王逸云等[17]對(duì)從海水里分離純化得到的一株小球藻做了10 種常用抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明這株小球藻對(duì)新霉素、慶大霉素、卡那霉素、頭孢霉素、鏈霉素和氨芐西林不敏感，對(duì)G418 和潮霉素敏感，對(duì)博來霉素和氯霉素非常敏感。陳穎等[18]對(duì)橢圓小球藻的抗生素敏感性做了研究，結(jié)果表明橢圓小球藻對(duì)鏈霉素、氯霉素和卡那霉素不敏感，對(duì)潮霉素敏感，對(duì)G418非常敏感。淦志兵等[19]進(jìn)行了原殼小球藻的抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明原殼小球藻對(duì)氯霉素不敏感，對(duì)卡那霉素、鏈霉素、壯觀霉素敏感，對(duì)潮霉素極其敏感，對(duì)G418 非常敏感。屈建航[20]對(duì)普通小球藻抗生素敏感性的實(shí)驗(yàn)研究表明，該小球藻對(duì)四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素和氨芐西林的敏感性不明顯。

目前有關(guān)沙漠環(huán)境中的小球藻基因工程選擇標(biāo)記篩選研究還未見報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們探討了4株沙漠小球藻的抗生素敏感性，發(fā)現(xiàn)4株沙漠小球藻對(duì)氨芐西林和頭孢霉素都不是很敏感，而對(duì)卡那霉素、氯霉素和鏈霉素都很敏感，這與淦志兵[19]的結(jié)果相符，但卻與王逸云[17]、陳穎[18]、屈建航[20]的研究結(jié)果不盡一致。造成這種差異的可能原因有：①藻種不同，對(duì)抗生素的敏感性也不同；②生長環(huán)境和所用培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不同，對(duì)抗生素的敏感性程度可能也不同。提示我們，在做某一類藻種的基因工程遺傳轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記研究時(shí)，均須進(jìn)行大量抗生素濃度梯度敏感性實(shí)驗(yàn)，以確定最佳遺傳轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記。

綜上，我們就4株沙漠小球藻對(duì)5種常用抗生素的敏感性做了初步研究，最終確定卡那霉素和鏈霉素可作為這4 株沙漠小球藻基因工程遺傳轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，為今后沙漠小球藻基因工程遺傳轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記提供了資料。

表2 不同抗生素作用下沙漠小球藻培養(yǎng)液顏色的變化

表3 4株沙漠小球藻對(duì)各抗生素的敏感性測(cè)定結(jié)果（μg/mL）

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