人乳頭瘤病毒18型L1蛋白的包涵體和可溶性表達及純化

麻粉蓮，張騫，鄭麗舒

中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）與人類多種疾病的發(fā)生有關(guān)，宮頸癌與HPV 感染密切相關(guān)。HPV L1 蛋白能夠自發(fā)組裝成病毒樣顆粒，具有與完整病毒相同的抗原空間表位，免疫后可產(chǎn)生高滴度的中和抗體。因此，L1蛋白是HPV 疫苗研究的主要靶抗原。我們采用GST標(biāo)記的原核表達系統(tǒng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1，HPV L1融合蛋白在大腸桿菌BL21 中以包涵體和可溶性形式高效表達，并建立了蛋白純化方法，獲得了HPV18 L1蛋白，為研究HPV疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（DE3）和DH5α感受態(tài)購于博邁德生物有限公司；pGEX-4T-1和pMD18-T載體均由本實驗室保存。凝血酶、谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B購自GE 公司；蛋白marker、T4DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa 公司；尿素、DTT、Tris、IPTG、氧化型和還原型谷胱甘肽購自Promega公司。

1.2 HPV18 L1序列的優(yōu)化及TA克隆

根據(jù)GenBank中HPV18 L1（NC_001357.1）序列和大腸桿菌密碼子嗜性優(yōu)化L1 序列，在5′和3′端分別引入限制性酶切位點EcoRⅠ和XhoⅠ，送Invitrogen 公司合成。將L1 序列連接至pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，測序鑒定。

1.3 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1的構(gòu)建

用EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒pMD18-THPV18 L1，用T4DNA 連接酶連接于經(jīng)同樣酶切的表達質(zhì)粒pGEX-4T-1上，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒，雙酶切和PCR鑒定。

1.4 HPV18 L1蛋白的表達

將鑒定正確的陽性克隆接種于含氨芐西林（l00 μg/mL）的LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，按1∶50 的比例轉(zhuǎn)接到LB 培養(yǎng)液中，當(dāng)菌液D600nm值達0.6 時加入IPTG 于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h（IPTG 終濃度為0.2 mmol/L）或于16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h（IPTG 終濃度為0.1 mmol/L），4℃、5000 r/min 離心10 min 收集菌體，重懸于PBS，超聲破碎細菌，離心收集上清和沉淀，12% SDS-PAGE鑒定并分析目的蛋白的表達。

1.5 HPV18 L1蛋白的純化

1.5.1 包涵體純化 經(jīng)12% SDS-PAGE 鑒定，37℃誘導(dǎo)時HPV18 L1 蛋白為包涵體形式，在破碎菌體的沉淀內(nèi)有大量目的蛋白。大量表達HPV18 L1蛋白，收集菌體，PBS 洗滌，加入菌體超聲波裂解緩沖液（20 mmol/L Tris-Cl，0.1 mmol/L EDTA，0.5 mol/L NaCl，0.1% TrixtonX-100，pH8.0）破碎菌體，4℃、5000 r/min 離心25 min，棄上清，收集沉淀；沉淀中加入包涵體洗滌液Ⅰ（50 mmol/L Tris-Cl，5 mmol/L EDTA，2 mol/L 尿素，0.5% Triton X-100，pH8.0）洗滌，4℃、12 000 r/min 離心30 min，收集沉淀；沉淀中加入包涵體洗液Ⅱ（50 mmol/L Tris-Cl，pH8.0）洗滌，離心后用雙蒸水洗滌沉淀，離心收集沉淀；用包涵體裂解液（50 mmol/L Tris-Cl，2 mol/L 尿素，pH12.0）溶解沉淀，將變性的包涵體裝入透析袋，用復(fù)性液Ⅰ（50 mmol/L Tris-Cl，0.1 mmol/L DTT，pH8.0）于4℃透析12 h，50 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）于4℃透析12 h，復(fù)性液Ⅱ（50 mmol/L Tris-Cl，0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽，1 mmol/L 還原型谷胱甘肽，pH8.0）于4℃透析12 h；透析結(jié)束，4℃、12 000 r/min 離心30 min，收集上清和沉淀；包涵體復(fù)性產(chǎn)物用0.45 μm 濾器過濾，用GST 4B 純化試劑盒純化；用PBS 平衡GST 柱子后將復(fù)性產(chǎn)物上樣，充分洗去雜蛋白，用還原型谷胱甘肽洗脫目的蛋白，收集不同峰值樣品，經(jīng)12% SDS-PAGE和Western印跡鑒定。

1.5.2 可溶性L1 蛋白的純化 經(jīng)12% SDS-PAGE鑒定，16℃誘導(dǎo)時HPV18 L1 蛋白為可溶性表達，在破碎菌體的上清和沉淀內(nèi)均有目的蛋白。大量表達HPV18 L1 蛋白，超聲波破碎菌體，收集上清，進行GST 4B親和純化。為去除分子伴侶，在破碎菌體中加入1 mmol/L ATP 孵育30 min，再加入3.5 mol/L尿素孵育30 min，4℃、14 400 r/min 離心75 min，收集上清，進行GST 4B親和純化。收集不同峰值的樣品，經(jīng)超濾管濃縮后，用50 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）于4℃透析18 h。每毫升蛋白加入20 U 凝血酶，22℃孵育8 h，用Western印跡鑒定酶切結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 HPV18 L1序列的優(yōu)化及TA克隆

HPV18 L1 基因全長1602 bp，編碼533 個氨基酸殘基。按照大腸桿菌密碼子嗜性優(yōu)化L1 基因序列后，密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）由0.228 上升為0.578，密碼子偏愛指數(shù)（CBI）由-0.09 上升為0.470，氨基酸序列未發(fā)生改變。測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pMD18-T-L1的序列正確。

2.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1 的雙酶切和PCR鑒定

用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HPV18 L1，同時進行PCR 鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在1600 bp 處均有目的條帶（圖1），表明L1基因成功插入pGEX-4T-1載體。

2.3 HPV18 L1蛋白原核表達的鑒定

經(jīng)12% SDS-PAGE 檢測，在37℃用0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達4 h，L1 蛋白以包涵體形式存在，在相對分子質(zhì)量約86 000 處可見明顯條帶（圖2），與HPV18 L1-GST融合蛋白預(yù)期大小吻合。在16℃用0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達24 h，L1 蛋白為可溶性表達，在破碎菌體的上清和沉淀中均有相對分子質(zhì)量約86 000的新增條帶，上清孔中約60 000的條帶為分子伴侶GroEL（圖3）。

2.4 包涵體形式表達的HPV18 L1蛋白的純化

12% SDS-PAGE 結(jié)果表明，包涵體經(jīng)洗滌后雜蛋白減少，目的蛋白含量較高。經(jīng)堿變性溶解包涵體，大量菌體被溶解。蛋白復(fù)性后用GST 4B進行親和純化，在相對分子質(zhì)量約86 000 處有單一條帶，為HPV18L1-GST融合蛋白（圖4）。

2.5 可溶性形式表達的HPV18 L1蛋白的純化

將破碎的菌體上清進行GST 4B親和純化，發(fā)現(xiàn)GroEL 和HPV18L1-GST 融合蛋白共同被純化，相對分子質(zhì)量分別為60 000 和86 000。但是，如果在超聲波破碎的菌體中加入ATP 和尿素作用后，經(jīng)GST 4B 親和層析純化可得到HPV18 L1-GST 融合蛋白，同時可去除GroEL（圖5）。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR（A）和酶切（B）鑒定

圖2 HPV18 L1表達的SDS-PAGE分析

圖3 HPV18 L1不同表達方式的SDS-PAGE分析

圖4 以包涵體形式表達的HPV18 L1蛋白的GST 4B純化

2.6 HPV18 L1-GST融合蛋白的Western印跡鑒定

包涵體形式表達的HPV18 L1-GST融合蛋白純化后降解條帶較多，而可溶性表達的融合蛋白純化后條帶單一，無蛋白降解現(xiàn)象（圖6）。

2.7 HPV18 L1-GST融合蛋白的凝血酶酶切

可溶性表達的蛋白純化后得到的HPV18 L1-GST 融合蛋白條帶單一，經(jīng)凝血酶酶切后可去除GST 標(biāo)簽，Western 印跡檢測顯示在相對分子質(zhì)量60 000 處有明顯條帶，能被HPV18 L1 特異性抗體識別，為HPV18 L1蛋白，相對分子質(zhì)量42 000處的條帶為L1蛋白的降解產(chǎn)物（圖7）。

3 討論

圖5 以可溶性形式表達的HPV18 L1蛋白的GST 4B純化

圖6 HPV18L1-GST融合蛋白的Western印跡

圖7 HPV18L1-GST融合蛋白的凝血酶酶切

外源基因在大腸桿菌中的高效表達受很多因素的影響。用pUC 表達載體表達HPV18 L1 蛋白時，目的蛋白發(fā)生降解，表達量低。本實驗采用了帶有GST 標(biāo)簽的原核表達載體pGEX-4T-1，GST 既能增加外源蛋白的可溶性，提高蛋白質(zhì)的表達量，又便于親合層析純化目的蛋白。本實驗構(gòu)建了pGEX-4T-1-HPV18 L1 重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)后HPV18 L1 以GST 融合蛋白的形式表達，SDS-PAGE 可見相對分子質(zhì)量86 000 條帶。37℃以0.2 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達4 h，蛋白為包涵體形式，經(jīng)洗滌、變性、復(fù)性和GST 4B 親和純化，可獲得HPV18 L1-GST 融合蛋白，但降解條帶較多。16℃以0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達24 h，蛋白為可溶性形式，經(jīng)去除分子伴侶GroEL、GST 4B親和純化和凝血酶酶切去除GST標(biāo)簽，可獲得HPV18 L1純化蛋白，但酶切效率有待提高。

尿素、鹽酸胍變性會破環(huán)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，使疏水性氨基酸殘基暴露在表面。包涵體溶解與尿素濃度、蛋白質(zhì)濃度和溶液pH 值有關(guān)。本實驗中，將包涵體在堿變性條件下溶解，將可溶部分用含有還原劑的中性緩沖液透析促進二硫鍵正確折疊，多余的還原劑可再次透析除去，大部分包涵體在50 mmol/L Tris（pH12.0）和2 mol/L 尿素中可以溶解。此方法既能保持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，又使蛋白質(zhì)溶解達到最大化[1]。在復(fù)性過程中，有許多條件影響目的蛋白的重折疊。一是細菌成分和雜蛋白的影響。低濃度尿素、TritonX-100 和EDTA 有利于除去脂類、脂多糖、核酸等雜質(zhì)。其次，復(fù)性時蛋白質(zhì)濃度很關(guān)鍵，蛋白質(zhì)濃度高于1 mg/mL，則復(fù)性得率低于10%，蛋白質(zhì)濃度為10～50 μg/mL時復(fù)性得率最高。三是小分子添加劑的使用。L1 蛋白含有12 個半胱氨酸殘基，為高度富含二硫鍵的蛋白質(zhì)，DTT、氧化型和還原型谷胱甘肽能夠促進L1蛋白的正確折疊。

將可溶性HPV18 L1 蛋白進行GST 4B 親和層析純化，同時得到分子伴侶GroEL 和HPV18L1-GST融合蛋白，這與Chen 的報道一致[2]。在蛋白質(zhì)折疊過程中，GroEL 結(jié)合伸展的肽鏈或折疊的中間態(tài)，并在ATP 和GroES 的作用下，水解ATP 釋放底物蛋白質(zhì)和能量，促進底物蛋白質(zhì)的折疊。GroEL 可通過不同的作用力與各種底物結(jié)合，利用層析技術(shù)也不能使其分開，說明兩者之間存在相互作用。去除與底物多肽緊密結(jié)合的GroEL 有三種方法：一是通過ATP 和大腸桿菌變性蛋白質(zhì)的作用可以有效去除GroEL[3]，但考慮到大腸桿菌變性蛋白中雜帶較多，我們未采取此方法。二是改變GroEL 的基因片段，使后期純化時無GroEL 存在[4]。三是ATP 和尿素共同作用去除GroEL。GroEL 具有ATP 激酶活性[5]。ATP 水解是誘導(dǎo)GroEL 構(gòu)象變化的關(guān)鍵，在ATP 的作用下，分子伴侶與目的蛋白之間從緊密結(jié)合變成疏松結(jié)合狀態(tài)。3.5 mol/L尿素可以打亂GroEL二級結(jié)構(gòu)[6]。ATP 結(jié)合GroEL 后，尿素能進一步誘導(dǎo)GroEL 和底物蛋白質(zhì)解聚，將目的蛋白從GroEL 上釋放出來，本研究即采用此法。

大腸桿菌表達系統(tǒng)是表達外源蛋白質(zhì)的首選系統(tǒng)。若大腸桿菌中表達的蛋白折疊成對熱不穩(wěn)定的中間體，便會促進包涵體形成。低溫表達可降低翻譯速率，使蛋白質(zhì)有足夠時間正確折疊，并能減少重組蛋白的熱變性，因此，低溫培養(yǎng)條件能在一定程度上抑制包涵體的形成。雖然低溫表達時延長了外源蛋白誘導(dǎo)時間，但相對于其后包涵體變性、復(fù)性等步驟的繁瑣，目的蛋白含量的損失和天然活性的喪失，本實驗選擇低溫表達HPV18 L1 蛋白是可行的。本研究建立了HPV18 L1 融合蛋白的純化方法，酶切去除了GST 標(biāo)簽，獲得了HPV18 L1 蛋白，是后續(xù)疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)。

[1]Khan R H,Rao K B C,Eshwari A N S,et al.Solubilization of recombinant ovine growth hormone with retention of nativelike secondary structure and its refolding from the inclusion bodies of Escherichia coli[J].Biotechnol Prog,1998,14(5):722-728.

[2]Chen X S,Gregory C,Stephen C H,et al.Papillomavirus capsid protein expression in Escherichia coli:purification and assembly of HPV11 and HPV16 L1[J].J Mol Biol,2001,307(1):173-182.

[3]Mattias R,Kimberly J H.Separation of copurifying Groel from glutathione-S-transferase fusion proteins[J].Protein Expr Purif,2000,20(1):45-47.

[4]Masayuki F,Lawrence S.Recombinant expression and purification of smad proteins[J].Protein Expr Purif,2000,20(3):507-513.

[5]Amnon H.Structural aspects of Groel function[J].Curr Opin Struct Biol,1998,8(1):93-100.

[6]Andreas B,Brian P S,Hanno E,et al.Isolation and biochemical characterization of highly purified escherichia coli molecular chaperone Cpn60(groel) by affinity chromatography and urea-induced monomerization[J].BBA Protein Struct Mol Enzymol,1995,1252(1):69-78.