樊愛琳,馬越云,鄭善鑾,楊麥貴,郝曉柯
第四軍醫(yī)大學(xué) 西京醫(yī)院檢驗科,陜西 西安 710032
結(jié)核病是危害人類健康的重要傳染病,我國的肺結(jié)核患者數(shù)量位居世界第二。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染人體后,絕大多數(shù)以潛伏感染(休眠菌)的形式存在?,F(xiàn)有的抗結(jié)核藥物可以有效殺死處于生長狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌,但對處在休眠狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌效果甚微。當(dāng)患者的抵抗力低下時,休眠的MTB 就會大量繁殖,重新處于致病狀態(tài)[1-2]。
研究發(fā)現(xiàn),在MTB 休眠菌的復(fù)蘇過程中,5 種促進(jìn)復(fù)活因子(resuscitation promoting factor,Rpf)發(fā)揮了重要作用,它們分別為RpfA、RpfB、RpfC、RpfD和RpfE[3],是由MTB分泌的。Rpf最早在藤黃微球菌(Micrococcus luteus)中被發(fā)現(xiàn)[4],它也是發(fā)現(xiàn)的第一個能夠促使休眠菌恢復(fù)生長繁殖能力的分泌型蛋白,是宿主免疫系統(tǒng)識別的靶抗原,其產(chǎn)生的特異性抗體能阻斷Rpf 蛋白對MTB 休眠菌的復(fù)蘇作用,因此Rpf 蛋白可能是預(yù)防和控制MTB 感染的新途徑。同源性分析發(fā)現(xiàn),在多種富含G+C 的革蘭陽性細(xì)菌中有Rpf樣蛋白存在,均具有Rpf樣結(jié)構(gòu)域[4]。Rpf蛋白結(jié)構(gòu)域是一個含77 個氨基酸殘基的截斷肽,位于Rpf 蛋白全長的A42~L118。研究發(fā)現(xiàn)Rpf 蛋白結(jié)構(gòu)域具有與Rpf 蛋白一致的生物學(xué)功能,其體外復(fù)活休眠菌的作用與完整的Rpf蛋白相同,也具有Rpf蛋白相似的免疫原性,誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體可能會阻斷MTB的Rpf家族的全部Rpf樣蛋白,抑制細(xì)菌的復(fù)蘇和生長[5]。MTB的5種Rpf樣蛋白功能重疊[6],實驗表明敲除其中任何一個Rpf 基因時,其生長不會受到明顯影響[7]。這表明MTB 的5 種Rpf 樣蛋白存在協(xié)同作用,共同對MTB 的休眠進(jìn)行控制。因此,如何對其進(jìn)行優(yōu)化組合將成為疫苗研發(fā)及實驗室檢測方法建立的重要障礙。研究表明,RpfB 在MTB 的生長中發(fā)揮較為重要的作用。RpfB 蛋白為膜蛋白,具有多種T 細(xì)胞和B 細(xì)胞抗原表位,突變RpfB 可明顯減緩H37Ra 的生長速度[8]。本實驗室前期的研究也發(fā)現(xiàn)RpfB 具有較強的生物學(xué)和免疫學(xué)特性[9]。因此,RpfB 結(jié)構(gòu)域可能是研究MTB Rpf 蛋白免疫學(xué)特性及生物學(xué)功能的切入點。為此,我們以原核表達(dá)純化的RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽作為免疫原,制備其單克隆抗體,為進(jìn)一步研究其生物學(xué)和免疫學(xué)特性提供了重要工具。
BALB/c 小鼠(雌性,6~8 周齡)由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供;結(jié)核桿菌H37Ra 株為陜西省結(jié)核病防治研究所惠贈;藤黃微球菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸桿菌DH5α為西京醫(yī)院檢驗科細(xì)菌室保存;Sp2/0 細(xì)胞系由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室饋贈;pPRO-EXHTRpfB domain 重組質(zhì)粒為本實驗室制備[10];PEG、HT及HAT 購自Promega 公司;6×His 單抗、HRP 山羊抗小鼠IgG 抗體購自華美生物公司;Ni2+-NTA 純化試劑盒購自Invitrogen公司。
將pPRO-EXHT-RpfB domain 原核表達(dá)載體接種于大腸桿菌DH5,用0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h,表達(dá)的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE 及Western 印跡鑒定,采用Ni2+-NTA 純化試劑盒按變性條件進(jìn)行親和色譜純化目的蛋白,采取逐步降低尿素濃度的方法除去尿素,使變性蛋白自然復(fù)性。
用純化的RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽免疫BALB/c 小鼠3次,每次間隔2 周;采用PEG1500 融合劑,將免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0 融合,用含HAT 的培養(yǎng)液培養(yǎng)融合細(xì)胞5 d,之后改用含HT 的培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d 至第8 d,用間接ELISA 法檢測培養(yǎng)上清抗體效價,將陽性孔用有限稀釋法進(jìn)行克隆化,建立單克隆細(xì)胞株。
將單克隆細(xì)胞株細(xì)胞密度調(diào)至1×109~2×109/L,進(jìn)行小鼠腹腔注射制備腹水,每只小鼠注射0.5 mL,注射后10~15 d可發(fā)現(xiàn)小鼠腹部明顯膨大,抽取腹水,采用正辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化。
用10 g/L 的RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽包被板子,加入系列稀釋的純化抗體,以HRP 標(biāo)記的羊抗鼠為二抗,用OPD 顯色。以Sp2/0 細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對照,免疫小鼠血清作為陽性對照。
將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,在37℃用50 g/L 脫脂奶粉封閉1 h,加入純化的單抗,濃度為100 mg/L,孵育1 h,用PBS 洗滌3次,再加入HRP-山羊抗小鼠IgG 抗體,37℃搖床孵育1 h,PBS洗滌3次,加入底物,用OPD顯色。
用RpfB結(jié)構(gòu)域多肽和無關(guān)的帶His標(biāo)簽的融合蛋白同時包被板子,以純化的單抗作為一抗,37℃孵育1 h,PBS 洗滌后與1∶1000 稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG抗體37℃反應(yīng)1 h,PBS洗滌,OPD顯色。
用6 種類和亞類特異性羊抗鼠多克隆抗體檢測不含血清的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清,呈陽性反應(yīng)的即可確定型別。
包被RpfB 結(jié)構(gòu)域2 mg/L,4℃過夜,洗滌后用10%小牛血清封閉1 h,加入系列稀釋(200~10-7μg/mL)的純化單抗孵育1 h,PBS洗滌后與1∶1000稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG 反應(yīng)1 h,洗滌后用OPD 顯色,讀取D490nm值并繪制曲線,觀察相對親和力。
分別用藤黃微球菌Rpf、Rpf 結(jié)構(gòu)域、MTB RpfB結(jié)構(gòu)域和MTB RpfA、H37Ra 菌株作為抗原包被板子,以制備的單抗(選取效價最高的一株B8G11)作為一抗,用ELISA 法檢測,觀察抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗與Rpf家族蛋白及MTB的交叉反應(yīng)。
取休眠狀態(tài)的MTB H37Ra 100 μL 轉(zhuǎn)接到5 mL 7H9培養(yǎng)基中,藤黃微球菌100 μL轉(zhuǎn)接到5 mL葡萄糖肉湯液體培養(yǎng)基中,分別加入不同濃度的RpfB結(jié)構(gòu)域蛋白和抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗,以0.01 mol/L PBS為陰性對照,每個濃度重復(fù)5管,37℃培養(yǎng),每3 h(27 h 后每6 h)取少量藤黃微球菌培養(yǎng)液測D600nm值,每5 d取少量MTB H37Ra株培養(yǎng)液測D600nm值,繪制各組MTB H37Ra和藤黃微球菌生長曲線。
原核系統(tǒng)表達(dá)的RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白為不可溶性的,SDS-PAGE 分析表明在Mr約為12×103處有蛋白表達(dá)帶,與目的蛋白大小吻合。在變性條件下純化目的蛋白,收集洗脫液進(jìn)行160 g/L SDS-PAGE 分析,發(fā)現(xiàn)在Mr為12×103處有清晰的條帶,經(jīng)薄層掃描分析融合蛋白純度可達(dá)90%以上(圖1)。
取小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0 與已免疫小鼠的脾細(xì)胞融合,融合后第8 d用間接ELISA 法檢測,有20孔為陽性,用有限稀釋法進(jìn)行克隆化,經(jīng)過3 次克隆化得到3 株可穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞系,分別命名為D3A5、B8G11、A9C8,其中D3A5、B8G11 屬IgG1亞類,A9C8 屬IgM 亞類。3 株單抗腹水純化后顯著增高(表1),Western 印跡分析表明該單抗可特異性識別RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽(圖2)。ELISA 結(jié)果顯示,帶His 標(biāo)簽的無關(guān)蛋白檢測為陰性,而RpfB 結(jié)構(gòu)域檢測為陽性,說明所獲得的單抗是針對RpfB 結(jié)構(gòu)域的,不是針對His標(biāo)簽的。根據(jù)間接ELISA檢測系列稀釋的單抗與RpfB 結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的D490nm值繪制曲線,以抗原抗體結(jié)合平臺期50%的D490nm值的抗體濃度表示單抗的相對親和力,結(jié)果D3A5、B8G11、A9C8的相對親和力分別為0.1、1和0.05 μg/mL,即A9C8>D3A5>B8G11(圖3)。
圖1 結(jié)核分枝桿菌RpfB結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析
表1 D3A5、B8G11、A9C8單抗效價
從表2 可以看出,抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可以與MTB RpfB 結(jié)構(gòu)域、MTB RpfA、藤黃微球菌Rpf、Rpf結(jié)構(gòu)域、H37Ra 菌株發(fā)生反應(yīng),說明抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可識別Rpf樣蛋白及其結(jié)構(gòu)域。
圖2 純化單抗的Western印跡
圖3 抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的相對親和力
表2 ELISA法檢測抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的交叉實驗
從不同濃度的RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白刺激藤黃微球菌和MTB H37Ra 的生長曲線可以看出,當(dāng)RpfB 結(jié)構(gòu)域濃度為1000 pmol/L 時刺激藤黃微球菌的復(fù)蘇和生長作用明顯,當(dāng)RpfB 結(jié)構(gòu)域濃度為500 pmol/L時刺激MTB H37Ra的復(fù)蘇和生長作用明顯,而且這種刺激作用在加入了1∶1000 的抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗后明顯被抑制(圖4、5)。
結(jié)核分枝桿菌感染率很高,多數(shù)感染者并不發(fā)病,是因為MTB 以休眠體狀態(tài)存在于體內(nèi)。Rpf 最先在藤黃微球菌中發(fā)現(xiàn)[5],它在細(xì)胞外以皮克(10-12g)水平通過自分泌和旁分泌形式發(fā)揮促進(jìn)休眠期細(xì)菌復(fù)活的作用。MTB含有5種Rpf樣蛋白,在功能上有一定的重疊,刪除任何一個編碼Rpf 蛋白的基因都不能明顯影響MTB 的生長,而當(dāng)3 個以上基因被刪除時,MTB 在體外才不能自發(fā)復(fù)蘇[7]。提示單個抗Rpf 抗體并不能完全阻斷所有Rpf 蛋白對結(jié)核菌復(fù)蘇和生長的促進(jìn)作用,只有3個以上抗Rpf抗體聯(lián)合應(yīng)用才能有效阻斷Rpf 蛋白對結(jié)核菌的促復(fù)蘇和生長作用。但如何對其進(jìn)行優(yōu)化組合,成為疫苗研發(fā)及實驗室檢測方法建立的重要障礙。
Vladimir 等的研究表明,藤黃微球菌Rpf 蛋白具有很強的免疫原性,用其免疫C57BL/6 小鼠后,可誘發(fā)T細(xì)胞增殖,引起IL-10、IL-12、γ-干擾素升高,其免疫血清可以抑制MTB H37Ra 的生長與增殖[11]。研究發(fā)現(xiàn),藤黃微球菌的Rpf蛋白與其Rpf蛋白結(jié)構(gòu)域具有一致的生物學(xué)功能[12]。Rpf 蛋白結(jié)構(gòu)域可能是一種理想的保護(hù)性抗原。
我們利用原核系統(tǒng)表達(dá)獲得了RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白,將純化的蛋白作為免疫原免疫小鼠,制備了3 株單克隆抗體,特異性高,親和力較強,經(jīng)小鼠腹腔注射制備腹水純化后獲得了較高純度的單抗,可識別多種Rpf 樣蛋白及其結(jié)構(gòu)域蛋白。由于Rpf 樣蛋白高度同源、Rpf樣蛋白結(jié)構(gòu)域高度保守[12],因此,推測抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可能會識別MTB Rpf 家族的全部Rpf 樣蛋白,這種推測有待于進(jìn)一步驗證。據(jù)此,有可能建立MTB 相關(guān)抗原的檢測方法,可以檢測處于不同感染階段的MTB Rpf 蛋白,這樣不僅可以克服Rpf 蛋白表達(dá)具有時相性難以檢測的缺陷,又達(dá)到了多種抗原聯(lián)合檢測的目的,可以提高M(jìn)TB 檢測的敏感性和特異性。
在觀察RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白對藤黃微球菌和MTB H37Ra 休眠菌促復(fù)蘇和生長作用的同時,我們還觀察了抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗對這種促復(fù)蘇和生長的抑制作用。結(jié)果顯示,抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可明顯抑制RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白對MTB H37Ra 和藤黃微球菌休眠菌的復(fù)蘇和生長作用。表明RpfB 蛋白結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)的特異性抗體可能會抑制機體內(nèi)潛伏感染的MTB的再次激活,具有控制隱性感染復(fù)發(fā)的作用。抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的制備,為進(jìn)一步研究RpfB結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)和免疫特性,評價其是否可作為候選結(jié)核亞單位疫苗的組分提供了實驗工具。
圖4 藤黃微球菌在RpfB結(jié)構(gòu)域蛋白及抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗作用下的生長曲線
圖5 MTB H37Ra在RpfB結(jié)構(gòu)域蛋白及抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗作用下的生長曲線
[1]Flynn J L,Chan J.Tuberculosis:latency and reactivation[J].Infect Immun,2001,69(7):4195-4201.
[2]Ulrichs T,Kaufmann S H.Mycobacterial persistence and immunity[J].Front Biosci,2002,7:458-469.
[3]Mukamolova G V,Turapov O A,Young D I,et al.A family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosis[J].Mol Microbiol,2002,46(3):623-635.
[4]Mukamolova G V,Kaprelyants A S,Young D I,et al.A bacterial cytokine[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(15):8916-8921.
[5]Mukamolova G V,Turapov O A,Kazarian K,et al.The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor[J].Mol Mirobiol,2002,46(3):611-621.
[6]Downing K J,Betts J C,Young D I,et al.Global expression profiling of strains harbouring null mutations reveals that the five rpf-like genes of Mycobacterium tuberculosis show functional redundancy[J].Tuberculosis,2004,84(3-4):167-179.
[7]Downing K J,Mischenko V V,Shleeva M O,et al.Mutantsof Mycobacterium tuberculosis lacking three of the five rpflike genes are defective for growth in vivo and for resuscitation in vitro[J].Infect Immun,2005,73(5):3038-3043.
[8]Tufariello J M,Mi K,Xu J.et al.Deletion of the Mycobacterium tuberculosis resuscitation promoting factor Rv1009 gene results in delayed reactivation from chronic tuberculosis[J].Infect Immun,2006,74(5):2985-2995.
[9]樊愛琳,師長宏,蘇明權(quán),等.抗藤黃微球菌Rpf結(jié)構(gòu)域單克隆抗體的制備與特性鑒定[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2008,24(5):448-451.
[10]樊愛琳,蘇明權(quán),師長宏,等.結(jié)核分枝桿菌Rv1009 結(jié)構(gòu)域基因的克隆、表達(dá)及親和層析純化[J].生物技術(shù)通訊,2007,18(4):579-582.
[11]Vladimir V,Yeremeev,Tatiana K,et al.Proteins of the Rpf family:immune cell reactivity and vaccination efficacy against tuberculosis in mice[J].Infect Immun,2003,71(8):4789-4794.
[12]Mukamolova G V,Murzin A G,et al.Muralytic activity of micococcus luteus Rpf and relationship to physiological activity in promoting bacterial growth and resuscitation[J].Mol Microbiol,2006,59(1):84-89.