人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)炎癥性腸病小鼠模型的治療作用

葛翠翠 ，王慧娜，杜麗欣，陳冬波，宋亞昆，2，吳東穎，2，劉兵，邱澤武，呂雙紅

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 附屬醫(yī)院 a.中毒救治科；b.307-青藤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心；北京 100071；2.北京青藤谷禧干細(xì)胞科技研究院有限公司，北京 100071

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一組特發(fā)性、慢性、炎癥性腸道疾病狀態(tài)，可以造成腸道結(jié)構(gòu)和功能不可逆的損傷。目前IBD 的治療主要采用糖皮質(zhì)激素、水楊酸類、免疫抑制劑等藥物，但這些藥物很難維持疾病長(zhǎng)時(shí)間的緩解，復(fù)發(fā)率很高，且副作用較大，價(jià)格昂貴。因此，尋找新的治療方法以延長(zhǎng)緩解期時(shí)間，降低致殘率，提高患者生活質(zhì)量，已是亟待解決的難題。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）最早從骨髓中分離，存在于脂肪、臍血、臍帶、胎盤、羊膜等多種組織中。MSC具有多向分化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等潛能，為治療許多復(fù)雜的疾病帶來希望。與骨髓來源的MSC 相比，人臍帶MSC（umbilical cordderived MSC，UCMSC）來源廣泛，易于取材，對(duì)供者不造成創(chuàng)傷，無倫理道德限制，并且具有細(xì)胞免疫原性低，增殖、分化能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，因此受到研究人員的廣泛青睞。目前已有應(yīng)用UCMSC 治療肝硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等疾病的臨床研究報(bào)道，并取得了較好的療效，但在IBD 研究方面尚處于起步階段。此外，以往的研究中多采用尾靜脈注射移植MSC，腹腔注射移植較少。但對(duì)于治療結(jié)腸炎而言，腹腔注射更接近損傷部位，且更加簡(jiǎn)便易行和安全。因此，我們擬探討2 種途徑移植人UCMSC 對(duì)TNBS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性BALB/c 小鼠，體重18～22 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，灌腸前在該中心適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7 d。

1.2 UCMSC的分離培養(yǎng)鑒定

取健康胎兒臍帶樣品沖洗干凈，剪成2～3 mm3的小塊，加入1%膠原酶消化液于37℃消化2 h，用70 μm 篩網(wǎng)過濾，收集上清，離心收集細(xì)胞，用PBS清洗后，加入5 mL 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，于37℃、5%CO2普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%～90%匯合時(shí)，按1∶2～1∶3 的比例傳代。動(dòng)物體內(nèi)移植采用6～8 代細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)UCMSC表面標(biāo)志的表達(dá)情況。

1.3 TNBS誘導(dǎo)小鼠IBD模型制備

2，4，6-三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）購(gòu)自Sigma 公司，為5%水溶液。按照4∶1 的比例配制丙酮-橄欖油混合溶劑，然后將該溶劑與TNBS以4∶1混合制備皮膚致敏液。將TNBS 與無水乙醇以1∶1混合制備TNBS灌腸溶液。

模型制備參考Wirtz等[1]的方法。小鼠背部剪去1.5 cm 見方的毛發(fā)，露出皮膚，每只小鼠涂150 μL皮膚致敏液后正常飼養(yǎng)，7 d 后用150 mg/kg TNBS灌腸。撫摸小鼠背部刺激遠(yuǎn)端大便排空；腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，倒懸位，將直徑0.2 mm聚乙烯管插入結(jié)腸4 cm處，緩慢灌入灌腸溶液，放回籠中正常飼養(yǎng)。觀察小鼠大便性狀、精神狀態(tài)等，每天記錄小鼠體重變化。7 d 后處死，取結(jié)腸進(jìn)行大體評(píng)分，并取受損部位石蠟包埋切片，HE 染色后進(jìn)行病理評(píng)分。

小鼠結(jié)腸組織大體評(píng)分按照Morris[2]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行（0 分：大致正常；1 分：無潰瘍，局部充血；2分：可見潰瘍，但無充血；3 分：僅1 處潰瘍和炎癥；4分：2 處或更多處的潰瘍和炎癥；5 分：潰瘍長(zhǎng)于2 cm；6～10 分：大于2 cm 的潰瘍，每增加1 cm 多計(jì)1分）。組織學(xué)評(píng)分參照Appleyard[3]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［水腫：0 或1（有或沒有）；潰瘍：0 或1（有或沒有）；細(xì)胞浸潤(rùn)：0，1，2 或3（無，輕度，重度）；肌層增厚：0，1，2或3（無，輕度，重度）；血管新生：0 或1（有或沒有）；黏膜結(jié)構(gòu)破壞：0 或1（有或沒有）；黏膜結(jié)構(gòu)喪失：0，1，2或3（無，輕度，重度）；合計(jì)總分］。

1.4 UCMSC輸注治療IBD

小鼠TNBS 灌腸造模后分為3組：對(duì)照組（n=8），灌腸后24 h 尾靜脈輸注PBS；尾靜脈治療組（n=11），灌腸后24 h 尾靜脈輸注2×105/只；腹腔移植治療組（n=10），灌腸后24 h腹腔輸注2×105/只。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料均以表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 人UCMSC的培養(yǎng)和鑒定

UCMSC 經(jīng)傳代培養(yǎng)后，顯微鏡下呈梭形，放射狀排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示（圖1）具有MSC 特征性表面標(biāo)志的表達(dá)。三系分化結(jié)果表明，可向骨、軟骨和脂肪方向分化。

2.2 腹腔和尾靜脈輸注UCMSC 對(duì)小鼠生存率和體重的影響

如圖2 所示，腹腔和尾靜脈輸注UCMSC 均可提高動(dòng)物生存率，腹腔輸注方式在改善小鼠生存率方面要優(yōu)于尾靜脈移植治療組。

如圖3所示，UCMSC移植后，尾靜脈移植治療組體重緩慢回升；腹腔移植治療組體重在移植后第2 d 降到最低，然后緩慢回升，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)體重恢復(fù)和尾靜脈移植治療組基本持平；對(duì)照組小鼠體重在第2 d體重降到最低，然后維持一個(gè)平穩(wěn)的水平。

圖1 人UCMSC的相差顯微鏡觀察（上）及流式細(xì)胞鑒定（下）

2.3 大體及病理組織學(xué)觀察和評(píng)分

移植后第5 d，取出小鼠全結(jié)腸，在解剖顯微鏡下觀察評(píng)分。對(duì)照組小鼠結(jié)腸全部可見潰瘍伴充血、水腫；尾靜脈移植治療組小鼠恢復(fù)較好，僅有個(gè)別動(dòng)物有潰瘍，且病變較??；腹腔移植治療組動(dòng)物結(jié)腸潰瘍減輕，而且病變范圍減小。大體評(píng)分結(jié)果顯示（表1），UCMSC 尾靜脈或腹腔移植后均可對(duì)潰瘍起到修復(fù)效果。

結(jié)腸石蠟包埋后切片，HE染色，光鏡下觀察（圖4），發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織腸壁增厚，黏膜層廣泛壞死，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)全層；尾靜脈移植治療組和腹腔移植治療組動(dòng)物有些僅見到腸壁略有增厚，但黏膜完整；有些僅在黏膜層見到輕微缺損，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較對(duì)照組減少。少數(shù)小鼠仍可見潰瘍，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有新生血管生成。與對(duì)照組相比，2種移植方式的結(jié)腸病理評(píng)分均顯著下降。

3 討論

圖2 小鼠生存曲線圖

圖3 對(duì)照組和治療組小鼠體重變化

表1 各組小鼠大體評(píng)分和病理評(píng)分結(jié)果

MSC 已用于多種疾病的治療研究。Tanaka 等[4]將骨髓來源的MSC 經(jīng)尾靜脈植入DSS誘導(dǎo)的IBD 動(dòng)物模型，證實(shí)MSC 可改善腸道損傷和炎癥反應(yīng)，其修復(fù)作用主要通過結(jié)腸局部抗炎作用完成。González 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，人脂肪MSC 可提高IBD 小鼠生存率，并且可阻止疾病復(fù)發(fā)。Zhang 等[6]采用牙齦來源的MSC 通過靜脈給藥，也觀察到GMSC 通過上調(diào)抗炎因子、下調(diào)致炎因子及氧自由基來修復(fù)IBD。這些研究采用不同來源的MSC治療IBD，都取得了療效，但這些MSC 仍存在來源有限、增殖能力有限或取材有創(chuàng)傷等缺陷。而UCMSC 因其來源充足，無創(chuàng)，MSC增殖、分化能力強(qiáng)，分泌多種活性因子等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣受青睞。但采用UCMSC 治療IBD的研究報(bào)道目前較少。梁璐等[7]應(yīng)用人UCMSC 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的IBD 進(jìn)行治療并探討其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其可以快速歸巢到有炎癥的腸道組織，并且可以明顯改善結(jié)腸炎的臨床表現(xiàn)和組織病理改變。

然而，MSC 移植后能否發(fā)揮治療作用受諸多因素的影響，如移植途徑、移植數(shù)量、移植時(shí)機(jī)、移植頻次等。在移植途徑方面，現(xiàn)有基礎(chǔ)研究和臨床研究多采用靜脈輸注方式，并取得較好的療效。但有關(guān)MSC 治療IBD 哪種移植途徑最佳問題尚有爭(zhēng)論。Castelo-Branco 等[8]報(bào)道，頸靜脈輸注MSC 未歸巢到受損腸組織，對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型沒有發(fā)揮治療效果；而經(jīng)腹腔注射MSC 可歸巢到結(jié)腸病灶并發(fā)揮療效，其主要分布于黏膜下層、肌層、固有層。Hayashi 等[9]證實(shí)，外源性BMSC 經(jīng)尾靜脈注射后不能改善大鼠一般狀況且不能修復(fù)受損腸組織，局部注射至受損組織邊緣效果較好。Ando 等[10]報(bào)道，黏膜下注射AT-MSC 到TNBS 誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型內(nèi)，F(xiàn)ISH 檢測(cè)到Y(jié) 染色體標(biāo)記的AT-MSC 主要分布在肌層和脂肪組織里。本研究探討了尾靜脈和腹腔注射2 條移植途徑所產(chǎn)生療效的差異。研究結(jié)果顯示，尾靜脈和腹腔注射移植UCMSC 均可對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型起到治療作用，降低大體和病理評(píng)分，但2 條途徑的療效無顯著差異。從數(shù)據(jù)上看，在改善生存率方面腹腔輸注UCMSC 優(yōu)于尾靜脈移植，而潰瘍修復(fù)效果上尾靜脈移植優(yōu)于腹腔移植。這可能意味著2種注射方式發(fā)揮治療作用的機(jī)理有差異。

圖4 結(jié)腸大體觀察圖片

圖5 HE染色圖片

此外，在移植細(xì)胞數(shù)量方面，文獻(xiàn)報(bào)道每只動(dòng)物一般移植1×106細(xì)胞，相當(dāng)于5×107/kg，雖然取得了一定的療效，但與臨床常用數(shù)量1×106/kg 比較，數(shù)量過大，因而降低了其對(duì)臨床應(yīng)用的指導(dǎo)意義。而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)較高細(xì)胞數(shù)量移植后動(dòng)物死亡率較高，因此根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用2×105/只（相當(dāng)于1×107/kg）進(jìn)行治療，結(jié)果顯示該細(xì)胞劑量也能起到治療作用，人UCMSC 注射移植后動(dòng)物體重恢復(fù)較快，死亡率降低，腸黏膜炎癥減輕，大體和病理評(píng)分均有所降低。這表明，較低UCMSC 即可對(duì)IBD 起到治療作用，但治療的最佳細(xì)胞數(shù)量（范圍）及其機(jī)理尚須進(jìn)一步探討。

本研究表明，采用尾靜脈和腹腔2 條途徑移植UCMSC 均可對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎起到治療效果，但具體治療機(jī)理尚須進(jìn)一步探討。

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