莊 靜，汪叢叢，呂慶亮，劉澤旺，秦寶寧，曹曉靖，孫長崗

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南京 210023;2.濰坊市中醫(yī)院，山東濰坊 261041;3.濰坊醫(yī)學(xué)院山東 濰坊 261000;4.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南 250355)

天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是從栝樓等葫蘆科植物根塊中提取的一種高分子蛋白質(zhì)，廣泛應(yīng)用于臨床治療［1］。天花粉蛋白可有效地通過抑制腫瘤細胞凋亡，是目前惡性腫瘤治療的一種全新治療手段。因?qū)φ＝M織毒副作用小、抗癌譜廣、價格低廉，使其較傳統(tǒng)化療藥物有顯著優(yōu)勢，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注［2］。本文旨在研究天花粉蛋白(TCS)對人肺腺癌A549細胞凋亡信號分子caspase-3表達的影響及其作用機制與JNK信號傳導(dǎo)通路激活的相關(guān)性，從細胞和分子水平上揭示TCS誘導(dǎo)A549細胞凋亡的機理，為天花粉蛋白在今后腫瘤防治中的應(yīng)用提供重要的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌A549細胞株購自上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司試劑部，天花粉蛋白(1.2 mg/ml)購自上海金山制藥有限公司，絲裂霉素、鏈霉素(10 mg/支)由浙江海正藥業(yè)公司生產(chǎn)，DMEM、新生胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)購自杭州四季青公司，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Promega公司)，碘化丙啶(PI)(美國 Sigma公司)，MTT(美國 Amresco公司)。SP600125(美國 Alexis公司)，鼠抗人β-actin抗體(美國 Sigma公司)，鼠抗人 JNK、鼠抗人caspase-3單抗及HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(美國SANTA CRUZ公司)，PVDF膜(美國BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞株A549采用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml，pH7.2)，常規(guī)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法測定TCS對人肺癌A549細胞增殖活性的影響 選取對數(shù)生長期的A549細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為1.0×105/ml，每孔加入新鮮培養(yǎng)液100 μl，37℃孵育24 h。實驗組分別加入不同濃度的 TCS 注射液(25、50、100 μg/ml)，同時設(shè)置對照孔(1‰DMSO)，每孔再設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸除原培養(yǎng)液，每孔加入20 μL的 MTT溶液(5 μg/ml)作用4 h。再加入100 μL二甲基亞楓(DMSO)，搖床緩慢震蕩15 min。設(shè)置A1為調(diào)零孔，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在OD(570 nm)處的光密度值(即A值)。計算細胞生長抑制率(%)=(1－實驗孔A值/對照組A值)×100%。

1.2.3 天花粉蛋白對肺癌A549細胞JNK信號通路的影響 取對數(shù)生長期A549細胞，各組分別加入不同濃度的 TCS 注射液(25、50、100 μg/ml)，常規(guī)培養(yǎng)48 h，調(diào)整細胞數(shù)為1×105/ml，每孔加入200 μl細胞懸液，且設(shè)3個復(fù)孔。加入細胞裂解緩沖液預(yù)處理，提取上清細胞總蛋白，分光光度法定量。再次離心取50 μg蛋白上樣到12%SDS-聚丙烯酰胺預(yù)制膠分離，印跡轉(zhuǎn)染醋酸纖維膜。用含5%脫脂干燥奶粉37℃封閉1 h。加入抗JNK(1∶1000)、p-JNK(1∶1000)抗體于4℃過夜。分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗37℃孵育1 h。加入ECL后沖洗、曝光，分析所顯影條帶的性質(zhì)。

1.2.4 天花粉蛋白對人肺癌 A549細胞Caspase-3 mRNA的表達 取對數(shù)生長期A549細胞，隨機分為對照組、SP組、25 μmol/mlTCS組以及TCS+SP組，處理細胞24 h，以5×105個/ml細胞濃度的肺癌A549細胞加入1 ml Trizol溶液，室溫放置5 min，使細胞充分裂解。常溫下離心，棄沉淀取上清液。按200 μl氯仿/ml Trizol的比例加入氯仿，震蕩15 min，按照Trizol試劑盒說明提取總RNA。引物設(shè)計參照Premier 6.0設(shè)計(如表1)。按照RTPCR試劑盒操作說明，其產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析電泳條帶，計算相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示，完全隨機分組實驗所得數(shù)據(jù)的多組比較采用方差分析，成組分析采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 MTT法測定TCS對人肺癌A549細胞增殖的影響

為觀察TCS對肺癌A549細胞生長的狀況，采用 MTT 法分析 TCS 在 0、25、50、100 μg/ml濃度處理后A549細胞增殖情況。MTT法顯示，TCS對人肺癌A549細胞株的生長抑制作用明顯，且呈時間和劑量依賴性，各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

表2 TCS對A549細胞增殖抑制作用

2.2 TCS對肺癌 A549細胞JNK、p-JNK蛋白的表達

為觀察TCS對肺癌A549細胞內(nèi)JNK信號通路的影響，我們采用Western blot法分析在不同濃度TCS處理后細胞內(nèi)JNK、p-JNK蛋白的表達情況。免疫印跡結(jié)果顯示，隨著天花粉蛋白濃度的升高，磷酸化JNK表達水平明顯高于對照組(P＜0.05);而JNK表達水平與天花粉蛋白藥物濃度無明顯變化(P ＞0.05)。

2.3 JNK通路介導(dǎo)的天花粉蛋白誘導(dǎo)肺癌細胞Caspase-3 mRNA的表達

為觀察JNK通路在 TCS對肺癌A549細胞caspase-3表達的作用，我們采用RT-PCR法分析由對照組、SP 組、25 μmol/mlTCS 組、50 μmol/mlTCS組以及TCS+SP組處理后，細胞內(nèi)Caspase-3 mRNA的表達情況。RT-PCR顯示，細胞內(nèi) Caspase-3 mRNA的表達量隨TCS濃度增加呈上升趨勢，2組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。預(yù)先加入JNK特異性抑制劑，Caspase-3表達量相較于對照組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1

圖2 TCS干預(yù)肺癌A549細胞Caspase-3mRNA表達的影響

3 討論

天花粉是我國傳統(tǒng)中草藥，為葫蘆科植物栝樓的塊根，因其粉潔白如雪，故名天花粉［3］。天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是天花粉的有效成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TCS具有多種藥理學(xué)活性，主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗人免疫缺陷病毒、引產(chǎn)等［4］。其生物學(xué)活性與其誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖能力有關(guān)，且天花粉蛋白對腫瘤細胞具有比較明顯的細胞選擇毒性。以往對天花粉蛋白的抗腫瘤研究主要集中在結(jié)構(gòu)、酶學(xué)功能、藥理作用等方面，對其引起腫瘤細胞凋亡和信號傳導(dǎo)的分子機制研究較少。因此，為更好地應(yīng)用于臨床，更多地為人們所認同，對天花粉蛋白抗腫瘤細胞作用的具體可能機制進行深入研究是非常有必要的。

Caspase-3是Caspase家族的最重要成員，是調(diào)控細胞凋亡的最終執(zhí)行分子，在細胞凋亡的過程中發(fā)揮著不可替代的作用［5，6］。細胞凋亡過程中Caspase-3作為下游信號分子主要有以下兩方面作用:一方面，其作為啟動物，接受凋亡信號而發(fā)生細胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng);另一方面，可作為效應(yīng)物水解各種細胞成分從而形成凋亡小體［7］。Caspase-3以無活性的酶原形式存在于細胞的內(nèi)部，只有經(jīng)過水解加工成活性片段才可以發(fā)揮生物學(xué)活性。JNK信號通路是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路的一個重要分支［8］，也是細胞信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中最重要的傳導(dǎo)通路之一，在調(diào)控細胞增殖分化、凋亡、應(yīng)激及參與細胞骨架調(diào)節(jié)等多種生理和病理過程中起至關(guān)重要的作用。

據(jù)文獻記載［9，10］，天花粉蛋白可以通過激活JNK信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細胞內(nèi)caspase-3蛋白的活化，是其抑制腫瘤生長的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實驗發(fā)現(xiàn)，TCS可明顯抑制A549細胞增殖活性，且與濃度和作用時間呈正相關(guān)。TCS誘導(dǎo)細胞凋亡的過程中伴有JNK信號通路的激活。磷酸化JNK蛋白的表達水平相應(yīng)增加，而JNK蛋白變化不顯著。此外，細胞內(nèi)Caspase-3 mRNA的表達量隨TCS藥物濃素增加呈上升趨勢。選取JNK特異性抑制劑SP600125，SP組Caspase-3 mRNA表達量相較于對照組減少。結(jié)果提示，TCS誘導(dǎo)caspase-3 mRNA活化的同時可能與JNK信號通路的激活有關(guān)。caspase-3酶原的激活對于天花粉蛋白誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡也是必不可缺的，JNK特異性抑制劑SP600125可有效地抑制細胞凋亡，在天花粉蛋白誘導(dǎo)肺癌A549細胞凋亡中，Caspase-3發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本實驗證實天花粉蛋白可以有效地抑制肺癌細胞的增殖，JNK信號通路的激活以及胞內(nèi)caspase-3蛋白的表達是其抑制腫瘤細胞生長的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。今后我們的實驗需要進一步涉及其他參與調(diào)控分子的研究，以便從細胞和分子水平上揭示TCS誘導(dǎo)A549細胞凋亡的機理，為天花粉蛋白在腫瘤防治中的應(yīng)用，提供重要的理論和實驗依據(jù)。

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