淡水石斑魚胚胎發(fā)育觀察

何杰

（ 中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，農業(yè)部淡水漁業(yè)和種質資源利用重點實驗室，江蘇無錫214081）

孫興馳，隋東海

（南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫214081）

淡水石斑魚（Cichlasoma managuense）隸屬鱸形目（Perciformes）鱺魚科（Cichlaidae）麗體魚屬（Cichlasoma），原產于中美洲，屬名貴魚類，1988年引入臺灣，1996年從臺灣引入大陸，成為淡水養(yǎng)殖的一個新品種［1］。目前，淡水石斑魚在重金屬毒性試驗［2－3］、含肉率和肌肉營養(yǎng)成分分析［4］、血細胞發(fā)生的觀察［5］、人工繁殖［6］、養(yǎng)殖［7－8］及病害防治［9］等方面已有一些研究，但其胚胎發(fā)育尚未見報道，而且麗體魚屬中也未見有胚胎發(fā)育方面的報道，但鱺魚科中尼羅羅非魚（Oreochrimis nilotica）［10－12］、莫桑比克羅非魚（Oreochrimis mossambca）［13］、盤麗魚（Symphysodon discus ）［14］、神仙魚（Pterophyllums carale）［15］的胚胎發(fā)育均有報道。本研究探討了淡水石斑魚胚胎發(fā)育的特征，以為魚苗的繁殖培育、品種改良提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 親魚的來源及培育

2010年6月從福建漳州購入一批淡水石斑魚水花，在淡水漁業(yè)研究中心宜興實驗基地養(yǎng)殖，2012年5月從越冬池中選擇個頭較大、身體強壯的雌雄魚各100尾，雌雄分開在溫室內進行強化培育。

1.2 親魚的挑選及人工催產

在7月初，挑選腹部發(fā)白、膨大明顯、顏色較淡的雌魚和體色鮮艷、身體強壯的雄魚，單尾重300～400g。在溫室內進行人工繁殖，20：00時注射催產素，雌魚每千克體重注射腦垂體1.5～3mg＋HCG 800～1000IU；雄魚劑量減半。注射后的雌、雄親魚用網箱分開放，池內充氣增氧，DO為8mg／L左右，水溫28℃。清晨5：00時，將4尾雌魚、6尾雄魚放入同一只網箱，讓其自然交配。此時，留人靜候觀察，發(fā)現(xiàn)雌魚產卵受精時開始計時，進行胚胎發(fā)育觀察。淡水石斑受精卵呈粘性，成片附著在網箱的網片上，剛產出為白色，遇水不久變?yōu)楣鉂傻乃?。結果交配的3只網箱，均有產卵。

1.3 樣本取樣和觀察

在水面下向網箱內輕折附有受精卵的網片時有許多卵粒脫落，用潔凈培養(yǎng)皿取得脫落卵粒，然后在Olympus生物顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育，并連接電腦放大成像。輕輕晃動培養(yǎng)皿，立體觀察，詳細記錄不同時間的發(fā)育特征，同時進行顯微攝影。觀察環(huán)境水溫（25.7±0.3）℃，每2h換水1次以保持胚胎正常發(fā)育。

2 結果與分析

在水溫（25.7±0.3）℃的環(huán)境中，淡水石斑魚的胚胎發(fā)育從受精卵開始至早期魚苗，歷時達56h，其中的35個階段顯著特征詳見表1。其胚胎發(fā)育過程可劃分為8個時期：胚盤形成期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經胚期、器官形成期、出膜期、卵黃期。

表1 淡水石斑魚胚胎發(fā)育期及其特征

2.1 胚盤形成期

淡水石斑魚受精卵為橢圓形，短軸（1.19±0.11）mm，長軸（1.51±0.13）mm，半透明，卵黃囊占據(jù)絕大部分體積，可見卵黃顆粒，動物極淺紅色（圖1－1）。受精幾分鐘后，動物極顏色逐漸變深同時隆起形成胚盤（圖1－2），至32min后，胚盤高度不再變化并積累營養(yǎng)物質為卵裂作好準備（圖1－3）。

2.2 卵裂期

受精后41min，卵裂開始發(fā)生，僅在動物極的胚盤正中央出現(xiàn)直線狀淡色溝，并逐漸加深，胚盤一分為二（圖1－4），然后兩側分別收縮并隆起，至1h9min時，形成2個大小均一饅頭狀細胞，完成第1次卵裂（圖1－5）；第2～4卵裂與第1次分裂方向垂直。至1h20min完成第2次分裂，形成形狀大小一致的4個分裂球進入4細胞期（圖1－6）；分裂球的中部逐漸形成縊痕，至1h47min完成第3次分裂，形成8個形狀大小基本一致的分裂球進入8細胞期（圖1－7）；第4次出現(xiàn)不同步分裂，有的細胞已分開，有的還連接在一起，形狀大小也產生差異，至2h2min完成第4次分裂進入16細胞期（圖1－8）；至2h19min完成第5次分裂，進入32細胞期，細胞分裂呈不規(guī)則兩層，細胞大小也不盡相同（圖1－9）；至2h48min細胞又完成第6次分裂，細胞顯著減小，進入64細胞期（圖1－10）；細胞越分越細，位于中央部分細胞分裂較快，長方形細胞團變成半球形，至3h14min進入多細胞期（圖1－11）；細胞分裂至3h49min時，細胞密集但仍可見單個細胞，隨后分裂細胞團四周收縮，高度逐漸增加，進入桑葚期（圖1－12）。

2.3 囊胚期

受精后4h55min進入囊胚期，細胞分裂更細，難以見到單個細胞，層數(shù)不斷增加疊起，最終呈僧帽狀的高囊胚期（圖1－13）；接著僧帽狀邊沿向下鋪展，囊胚細胞向四周延伸，囊胚高度逐漸降低，至5h57min類似早期胚盤（四周與卵黃交界處有亮環(huán)而與胚盤相異），進入平囊胚期（圖1－14）。

2.4 原腸胚期

受精后7h16min進入原腸胚早期，囊胚細胞開始從動物極下包植物極，可見囊胚腔和早期胚環(huán)（圖1－15），下包至1／5處時胚環(huán)顯著，囊胚腔縮?。▓D1－16）；至8h23min下包至1／2處，形成原腸胚中期，可見胚盾，胚盾始于動物極止于胚環(huán)（圖1－17）；在繼續(xù)下包過程中，胚環(huán)形成的縊痕逐漸加深，胚盾顯著增粗并與胚環(huán)一起下移并延伸（圖1－18），至9h48min下包至2／3處，胚盾顏色開始轉淡，下包過程中卵黃囊被擠而部分凸出胚環(huán)外，進入原腸胚后期（圖1－19）；至10h50min下包至4／5，進入原腸胚末期，卵黃囊小部分被擠而突出形成泡狀（圖1－20）。

2.5 神經胚期

受精卵發(fā)育至11h47min時出現(xiàn)神經胚，胚體頭部增高，出現(xiàn)腦泡，初現(xiàn)胚體輪廓，卵黃囊即將被包完，部分卵黃凸出似脫痣狀卵黃栓（圖1－21）；發(fā)育至11h52min，胚孔即將封閉，呈火山狀，胚體頭前端有細管連接。胚體索狀，向外凸出卵膜外成脊，向內擠壓卵黃囊成溝（圖1－22）；至13h19min，神經胚頭端抬起，出現(xiàn)體節(jié)，黑色素開始大量出現(xiàn)，體節(jié)延伸到植物極底端（圖1－23）。

2.6 器官形成期

2.6.1 泡形成期

受精后16h23min，尾部出現(xiàn)透明小泡，介于卵膜與卵黃囊之間，體節(jié)較粗壯，視芽（視泡前身）可見（圖1－24）；至21h11min，胚體扭動，胚尾扭轉，掙脫膜的束縛，在卵膜與卵黃囊之間露出游離空間（圖1－25），進入尾芽期；至23h9min，胚體頭部兩側出現(xiàn)隆起形成泡狀，進入視泡期（圖1－26）；至27h43min，視泡后出現(xiàn)較小泡狀物為聽泡，此時胚體頭前端有一小管連接，可見管內流動淡紅色液體（圖1－27）。至30h36min出現(xiàn)腦泡，胚體頭部初具魚苗頭部輪廓，卵黃囊上開始出現(xiàn)黑色素顆粒（圖1－28）。

2.6.2 心臟期

受精后34h29min為心臟前期，出現(xiàn)透明狀管泡狀物即心芽，胚體頭前端管狀物粗大，管內液體流動速度很快不易察覺，動物極下的卵黃過分吸收具明顯缺刻（圖1－29、圖1－30），胚體頭部進一步發(fā)育體積增大近1倍（圖1－30）；至38h37min，可見圓環(huán)形晶體輪廓（圖1－31），晶體環(huán)由不同的弧形小片組成；至38h56min為心臟中期，胚體頭前端管膨大呈囊狀，鑲嵌于卵黃囊上，可見有液體從卵黃囊四周流向胚體頭部（圖1－32，1－33）；至43h26min，胚體異?；钴S有力，胚體長度為此時卵徑周長的3／4，在卵黃囊與卵膜之間間歇性擺動4～5秒扭動1次，卵黃囊被擠壓呈不同形狀（圖1－34）；至47h 39min為心臟后期，心臟跳動有力，心率為38，胚體頭前端囊狀管液體流呈紅色（圖1－35）。

2.6.3 血液循環(huán)期

受精后48h53min進入血液循環(huán)前期，囊狀管向卵膜一端分出4分支小管，為血液流出方向，可見小管內有快速流動的血液（圖1－36、1－37）；至49h58min為血液循環(huán)后期，可見囊狀管向卵黃囊一端有4支粗管，為血液流入方向，小管內血液顏色較鮮艷，心率增加至53（圖1－38、1－39）。

2.7 孵化出膜

受精后52h24min，胚體運動擠壓卵黃囊，囊狀管被埋入卵黃囊內，尾尖處卵膜首先瞬間爆裂，內容物和卵黃苗被彈出（圖1－40）。至56h53min，為卵黃苗前期，魚苗呈彎曲狀，身體前部附著在卵黃囊上（圖1－41）；至77h46min，為卵黃苗后期，魚苗身體平直透明，游動有力，卵黃囊顯著縮?。▓D1－42）。魚苗孵出后會擠在一起尾部朝同一方向不斷擺動，形成微環(huán)循水體，此后進入親魚護崽階段。

3 討論

淡水石斑魚屬分批產卵熱帶魚類，在繁殖季節(jié)很難判斷雌魚體內卵子發(fā)育的成熟情況，繁殖前雌雄分開進行強化培育十分必要，否則人工繁殖較難獲得成功。孵化水溫對魚苗繁殖具有重要意義，從48種魚類平均溫度和發(fā)育時間來看，平均溫度增高，發(fā)育時間縮短［16］，如冷水性魚類山女鱒（Oncorhynchus masou masou）低于4℃比8℃時的孵化時間要長30d［17］，淡水石斑魚在水溫26～29℃時，48h可孵出仔魚［1］。本研究采用孵化水溫近26℃，孵化時間為56h，孵化水溫還有提升的空間。

淡水石斑魚胚胎發(fā)育從第4次分裂起，分裂相細胞排列趨向紊亂，不如泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）［18］、胭脂魚（Myxocyprinus asiaticus）［16］等魚類分裂細胞排裂整齊。受精卵外觀和發(fā)育與同科的盤麗魚胚胎發(fā)育較為近似［14］，與同科的羅非魚相比，后者受精卵為卵圓形，動物極較尖，淡黃色不會遇水變得透明，發(fā)育過程中的血管系統(tǒng)也不如淡水石斑魚發(fā)達［10－12］。

淡水石斑魚胚胎發(fā)育形成了較為復雜的胚胎血液環(huán)循系統(tǒng)，其卵黃囊較軟，胚環(huán)的下移和胚體的活動都能輕易改變其形狀，這些特征與運動相關因此需氧量也相對較高，所以淡水石斑魚胚胎發(fā)育耗氧較高，所以有親魚護卵習性，用鰭扇動水流，從而增加氧氣，否則受精卵會發(fā)白，不久即死亡。

在心臟形成中、后期，胚體頭部端管膨大成囊狀，內部流動著無色液體也轉化為淡血色至鮮紅色，囊狀物類似心臟，但無搏動現(xiàn)象，末起到心臟搏動提供動力作用，后來其發(fā)育去向不明，其原因還需要做進一步研究。同時在心臟中、后期和出膜前期，胚體也異常活躍，對環(huán)境條件的變化也比較敏感，通過觀察發(fā)現(xiàn)，此階段如從25.7℃降至18℃，出膜后的魚苗出現(xiàn)水泡胸，不久死亡。幼苗破膜而出同時伴有大量的廢物質釋放，水質易惡化，所以在受精卵在出膜階段，適宜的水溫和豐富的溶氧有利于幼苗成活和正常發(fā)育。

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